Осаждение белка минеральными и органическими кислотами
Принцип метода: Осаждение белка минеральными и органическими кислотами объясняется как явлением дегидратации белковых частиц, так и нейтрализацией их зарядов. В избытке серной и соляной кислот выпавший осадок денатурированного белка в результате перезарядки белковой молекулы может растворяться.
Ход работы:В четыре пробирки наливают по 5 капель 1%-го яичного белка, в первую пробирку добавляют 5 капель концентрированной серной кислоты, во вторую - 5 капель концентрированной соляной кислоты, в третью - 1-2 капли 10%-ной сульфосалициловой кислоты, в четвертую - 1-2 капли 10%-ной трихлоруксусной кислоты. Делаются выводы по работе.
Высаливание белков
Принцип метода:В присутствии нейтральных солей(сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат магния, хлористый натрий и т. д.) заряд белков нейтрализуется, что понижает их устойчивость в растворе. Данный процесс носит название высаливания и является обратимым.
Ход работы:В пробирку наливают 20 капель неразведенного яичного белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, содержимое перемешивают, выпадает осадок яичного глобулина.
Осадок отфильтровывают, а к надосадочной жидкости добавляют порошок сульфата аммония. При этом в осадок выпадает яичный альбумин. Делаются выводы по работе.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2. Количественное определение белка по методу Биурета.
Принцип метода:Белки, реагируя в щелочной среде с сернокислой медью, окрашиваются в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски зависит от количества белка в пробирке. Определив оптическую плотность раствора (экстинцию) в нескольких пробирках с известным количеством белка, можно построить график зависимости экстинции от количества белка - калибровочную кривую, по которой, зная экстинцию пробирки с неизвестным количеством белка, легко определить его количество.
Ход работы:К 5 мл биуретового реактива добавляют 0,1 мл яичного белка. Через 15 мин. пробу колориметрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре. Показатель экстинции учитывают в сравнении с контрольной пробой. Расчет ведут по калибровочной кривой. Делаются выводы по работе.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА№ 3. Определение молекулярной массы белков при помоши электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН)
Принцип метода:Электрофоретическое разделение белков в ПААГ основано на способности белков двигаться в электрическом поле. ПААГ обладает пористой структурой благодаря поперечным сшивкам, создающим молекулярное сито, сквозь которое белки будут двигаться в зависимости от их заряда, формы и размеров.
Метод ДСН-электрофореза в ПААГ позволяет разделять белки по их молекулярной массе, поскольку все белки, связывая ДСН, становятся отрицательно заряженными.
Ход работы:К 10 мл раствора акриламида добавляют 1 мл раствора бисакриламида, 15 мл фосфатного буфера, содержащего 0,1%-ный ДСН, , 2,5 мл воды, 1,5 мл раствора персульфата аммония и 0,04 мл ТЕМЕД, катализирующих полимеризацию акриламида. Полученную смесь осторожно перемешивают и заливают в электрофоретическую кювету. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 0,5-1 см от верхнего края кюветы. Сверху осторожно вставляют гребень для формирования карманов геля, в которые после полимеризации геля вносят анализируемые образцы. Предварительно образцы белков кипятят 5 мин в присутствии 1%-го ДСН и 1%-го b-меркаптоэтанола, восстанавливающего сульфгидрильные группы белков, добавляют глицерин до 1%-ной концентрации и краситель.
После того как кювета помещена в прибор для электрофореза, заливают в него 0,02 М натрий-фосфатный буфер и вносят в каждый карман геля по 10-50 мкл образца белка. Электрофорез проводят при напряжении 120 - 150 В до тех пор, пока фронт красителя не дойдет до нижнего края геля.
После завершения электрофореза гель вынимают из кассеты и помещают в раствор красителя кумасси бриллиантового синего. Время окрашивания 30-60 мин, после чего гель помещают в 7%-ный раствор уксусной кислоты для отмывки геля. Затем гель помещают на фильтровальную бумагу и высушивают в вакуумной сушилке.
По электрофореграмме определяют электрофоретическую подвижность (Rf) маркерных белков, которая равна отношению расстояния, пройденного каждым белком от линии старта к расстоянию, пройденному красителем.
Находят десятичные логарифмы молекулярных масс маркерных белков и строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс значения Rf, а по оси ординат - логарифмы молекулярных масс. Используя калибровочный график, находят логарифм молекулярной массы исследуемого белка.
РАЗДЕЛ II. ФЕРМЕНТЫ
ЗАНЯТИЕ 3
ТЕМА: Строение и общие свойства ферментов.
ЦЕЛЬ: Изучить химическую природу ферментов, их строение и свойства.
ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Понятие о ферментах как биологических катализаторах. Химическая природа ферментов.
2. Строение ферментов. Кофакторы. Активный центр ферментов. Изоферменты.
3. Свойства ферментов: термолабильность, зависимость активности от рН среды, специфичность.
Оснащение занятия:
Реактивы: 1. a-амилаза слюны
2. пепсин
3. трипсин
4. крахмал 0,5%-ный
5. буферные растворы: рН-2, рН-7, рН-9
6. йод 5%-ный спиртовый раствор
7. окрашенный денатурированный яичный белок
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Влияние температуры на активность амилазы слюны.
Принцип метода: Для ферментов характерно такое свойство белков как термолабильность. Для большинства ферментов скорость ферментативного катализа при увеличении температуры возрастает, достигая максимума при температуре 38-40° С, выше которой скорость ферментативной реакции начинает падать ввиду тепловой денатурации молекул фермента.
Крахмал в присутствии ионов йода дает синее окрашивание, по интенсивности которого можно судить об активности амилазы, гидролизующей молекулы крахмала.
Ход работы:В 3 пробирки вносят по 0,5 мл слюны и 0,5 мл раствора крахмала. Первую пробирку ставят в стакан со льдом, вторую - в водяную баню с температурой воды 38°С, а третью - в кипящую водяную баню. Все пробирки инкубируют 10 мин, после чего пробирки помещают в штатив и добавляют в каждую по 5 капель раствора йода.
Делают выводы по работе.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2. Влияние рН среды на активность пепсина и трипсина.
Принцип метода:Активность ферментов зависит от рН среды, в которой они находятся. Пепсин и трипсин гидролизуют пептидные связи белков. рН-оптимум для пепсина равен рН2, в то время как рН-оптимум трипсина - рН 7.
При инкубировании окрашенных кусочков денатурированного яичного белка с ферментом краситель будет переходить в раствор в результате гидролиза молекул яичного белка. Чем выше будет активность фермента, тем интенсивнее будет окрашиваться раствор.
Ход работы:В три пары пробирок наливают по 2 мл буферного раствора с рН2, 7 и 9. В каждую пробирку вносят по кусочку (20-30 мг) окрашенного яичного белка. В первый ряд пробирок добавляют по 20 мг пепсина, а во второй ряд - по 20 мг трипсина и инкубируют 15 мин при 37°С периодически помешивая растворы.
Делают выводы по работе.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3. Определение специфичности действия амилазы и трипсина.
Принцип метода:Способность катализировать только определенные химические реакции связано с таким свойством ферментов как специфичность. Субстратом амилазы являются полисахариды (крахмал, гликоген), а субстратом трипсина - белки.
Ход работы:Берут 4 пробирки. В пробирку № 1 и 2 добавляют по 0,5 мл раствора крахмала, а в пробирки № 3 и 4 - по кусочку окрашенного яичного белка и по 0,5 мл воды. Затем в пробирки № 1 и 3 добавляют по 0,5 мл слюны, а в пробирки № 2 и 4 - по 0,5 мл 1%-го раствора трипсина. Все пробирки инкубируют при 37°С в течение 10-15 мин.
Делают выводы по работе.
ЗАНЯТИЕ 4
ТЕМА: Механизм действия ферментов. Кинетика ферментативной реакции.
ЦЕЛЬ: Изучить механизм ферментативного катализа, особенности протекания ферментативной реакции.
ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Механизм ферментативнго катализа. Теория “ключа и замка” и “индуцированного соответствия”.
2. Явление насыщения молекул фермента молекулами субстрата.
3. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Константа Михаэлиса.
4. Методы определения и единицы измерения активности ферментов.
Оснащение занятия:
Реактивы: 1. a-амилаза слюны(разведенная 1: 10)
2. крахмал 0,1%-ный
3. йод 5%-ный спиртовый раствор
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Определение активности a-амилазы слюны по Вольгемуту.
Принцип метода:Метод основан на установлении предельного разведения раствора a-амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до декстрина.
Ход работы:В 10 пробирок наливают по 1 мл воды, затем в пробирку №1 добавляют 1 мл разбавленной в 10 раз слюны, перемешивают, отбирают 1 мл и переносят в пробирку №2 и т.д. Во все пробирки добавляют, начиная с десятой, по 2 мл 0,1%-го раствора крахмала и инкубируют 30 мин при37°С. Затем пробирки охлаждают и добавляют по 1 капле раствора иода. Отмечают пробирку с наибольшим разведением слюны, при котором произошло расщепление крахмала до декстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание. Активность a-амилазы выражают количеством миллилитров крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37°С в течение 30 мин до декстрина.
В норме активность амилазы (А 37°/30¢) составляет160-640 единиц.
ЗАНЯТИЕ 5
ТЕМА: Регуляция активности ферментов. Активаторы и ингибиторы ферментов. Классификация ферментов.
ЦЕЛЬ: Изучить влияние активаторов и ингибиторов на скорость ферментативных реакций, понять принципы классификации ферментов.
ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Факторы, влияющие на активность ферментов.
2. Активаторы ферментов.
3. Ингибиторы ферментов. Типы ингибирования (специфическое, неспецифическое, обратимое, необратимое, конкурентное, неконкурентное).
4. Классификация ферментов.
Оснащение занятия:
Реактивы: 1. a-амилаза слюны(разведенная 1: 10)
2. крахмал 0,5%-ный
3. йод 5%-ный спиртовый раствор
4. сернокислая медь - 1%-ный раствор
5. хлористый натрий - 1%-ный раствор
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. Влияние активатора и неспецифического ингибитора на активность a-амилазы.
Принцип метода:Ионы хлора являются активаторами a-амилазы, поэтому гидролиз крахмала должен происходить быстрее в присутствии хлорида натрия. Тяжелые металлы вызывают денатурацию белков, что приводит к утрате их биологической активности.
Ход работы:Берут три пробирки. Во все пробирки наливают по 2 мл крахмала. В первую пробирку добавляют 1 мл воды, во вторую - 1 мл хлорида натрия, в третью - 1 мл сульфата меди, после чего во все пробирки добавляют по 1 мл разбавленной слюны, и инкубируют 5-10 мин при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавляют по 1 капле иода.
Делают выводы по работе.