Изучение энергии активации биологических процессов

ГОУВПО «Мордовский государственный университет

Имени Н.П. Огарёва»

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

ПО БИОФИЗИКЕ

САРАНСК

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОРДОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Лабораторный практикум по биофизике: Методические указания для студентов биологического факультета / Мордовский гос.ун-т; Сост. В.В. Ревин. - Саранск, 2010.

В методическом пособии дается описание лабораторных работ по основным разделам курса «Биофизика». Данное пособие рекомендовано для студентов биологического факультета специальностей «Биология», «Биоэкология», «Биохимия» и «Биотехнология».

Печатается по решению редакционно-издательского Совета Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарёва.

Составитель: доктор биологических наук Ревин Виктор Васильевич

Предисловие

В последние годы для решения как фундаментальных, так и прикладных задач отводится биофизике. Биофизика – это наука, изучающая физические и физико-химические процессы, протекающих в биологических системах на молекулярном, клеточном и организменном уровнях. Данная наука относительно молодая. Она возникла на стыке наук между физикой, химией и биологией. На сегодняшний день она оперирует различными методами исследований, к которым в свою очередь предъявляются высокие требования. Применение биофизических методов длжно предполагать сравнительно небольшое количество исследуемого биологического материала. Методы должны также обладать высокой чувствительностью и позволять проводить иследования в условиях, близких к естественным.

Лабораторная работа №1

Изучение энергии активации биологических процессов.

Живой организм представляет собой открытую систему, которая постоянно обменивается с окружающей средой веществом и энергией. Вещества, попадающие в организм извне, вступают в сложный процесс физико-химических превращений. В скорость их в отдельных органоидах, клетках и в целом организме играет решающую роль в регулировании жизненного процесса. В связи с этим важное значение приобретает изучение закономерностей протекания в организме химических реакций.

Биологическая кинетика изучает скорость биологических процессов и ее зависимость от концентрации веществ, участвующих в биологических превращениях, а также от внешних условий, в частности от температуры. Такая зависимость понятна, если учесть, что любое химическое превращение, происходит при условии соударения молекул, находящихся в беспорядочном тепловом движении. По мере повышения температуры увеличивается длина пробега молекул и, следовательно, вероятность их столкновения друг с другом. Таким образом, относительное количество молекул, с повышением температуры увеличивается, как и скорость реакции.

Величину, показывающую, во сколько раз возрастает количество активных молекул (а следовательно, и скорость реакции) при повышении температуры на 10⁰С, называют температурным коэффициентом и обозначают символом Q₁₀ (коэффициент Вант-Гоффа).

Между величиной температурного коэффициента реакции Q₁₀ и той избыточной энергией, которой должны обладать молекулы, чтобы их соударение привело к химической реакции (как называемой энергией активации Е), существует зависимость, которую выражают формулой

Е=0,46•Т₁Т₂lgQ₁₀, (1.1)

где Е – энергия активации, кДж; Т₁ и Т₂ – температуры, выраженные в градусах абсолютной шкалы с разницей в 10⁰С (Т₂= Т₁+10); lgQ₁₀ – десятичный логарифм температурного коэффициента (Т⁰К=t⁰С+273⁰).

Приведенной формулой пользуются для определения энергии активации биологических процессов, в том числе секреции желез, пульсации сократительных вакуолей простейших, сокращения мышц и т.д. Для вычисления энергии активации какого-либо биологического процесса необходимо:

1) определить его скорость при двух температурах - Т₁ и Т₂;

2) найти величину Q₁₀, разделив значение скорости, полученное при Т₂, на число, полученное при Т₁;

3) найти по таблице логарифмов десятичный логарифм Q₁₀ и подставить в формулу (1.1) значение в градусах абсолютной шкалы.

Энергия активации рассчитывается не только для отдельных реакций и процессов, но и для клеточного и органоидного уровня. В связи с этим проведем расчет энергии активации мембраносвязанного фермента Na-,K-АТФ-азы (молекулярный уровень) и интенсивности сердцебиения лягушки при разных температурах (органоидный уровень).

Упражнение I. Влияние температуры на ферментативную активность Na-, К-АТФ-аза.

Принцип метода.При работе Na-, К-АТФ-аза от молекулы АТФ отщепляется одна молекула неорганического фомфора и остается одна молекула АДФ. По нарастанию неорганического фосфора и остается одна молекула АТФ. По нарастанию неорганического фосфора и инкубационной среде судят об активности АТФ-азы:

АТФ → АДФ + Р_н.

Цель работы. Установить зависимость скорости образования неорганического фосфора от температуры. Рассчитать коэффициент Вант-Гоффа и энергию активации.

Приборы:

1. Фотоэлектроколориметр (ФЭК),

2. Ультратермостат,

3. Аналитические весы, разновесы.

Посуда:

1. Чашки Петри

2. Стеклянные пробирки объемом 10 мл

3. Пипетки на 1 и 2 мл

4. фарфоровая чашка с пестиком.

Реактивы и материалы:

1. Фильтровальная бумага (синяя лента),

2. 18 мМ раствор АТФ,

3. 6,6% раствор молибденовокислого аммония,

4. 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота),

5. 2,5% раствор FeSO₄,

6. 7,5 Н раствор H₂SO₄,

7. 0,05 М трис-HCl с 7,5,

8. 18 мМ раствор MgCl₂,

9. 5,4 мМ NaCl,

10. 18 мМ раствор KCl,

11. ножницы.

Ход работы:

Перед началом опыта необходимо включить термостат (положение HI), предварительно поставив регулятор контактного термометра на 30⁰С. Работу нужно начинать только при достижении в термостате заданной температуры. Опыты состоят из 2 серий:

1) контроль и опыт при температуре инкубации 20⁰С (комнатная температура);

2) контроль и опыт при температуре инкубации гомогената 30⁰С.

Для определения активности фермента берут 50 мг живой ткани (сердце, почка, нерв, мозг), растирают его в фарфоровой ступке с 3 мл трис-HCl буфера (рН 7,5). Полученный гомогенат доводят трис-HCl до конечного объема – 10 мл. После этого отбирают пипеткой 1 мл полученного гомогената и переносят его в пробирку, добавляют 4 мл инкубационной смеси. Инкубационная смесь состоит из 1 мл 0,05 М трис-HCl, 18 мМ раствор MgCl₂, 1 мл 18 мМ раствор KCl, 1 мл 5,4 мМ NaCl, рН полученного раствора – 7,5. Затем пробирки первой серии выдерживают при 20⁰С 1 мин. После этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл 18 мМ раствора АТФ, в контрольную пробу до добавления АТФ вносят 1 мл 20% раствора ТХУ для инактивации фермента. После 5-минутной инкубации при 20⁰С реакцию прекращают добавлением 1 мл 20% раствора ТХУ (в контрольную пробу ТХУ второй раз не добавляют). Для дальнейшего анализа берут в пробирки по 1 мл исследуемого раствора (контрольный и опытный) и добавляют туда же 2 мл 7,5 н H₂SO₄, 2 мл 6,6% молибденовокислого аммония и 2 мл 2,5% раствора FeSO₄ (свежеприготовленного). Аналогичный опыт проводят при температуре 30⁰С.

Активность фермента определяют по калибровочной кривой в зависимости от величины оптической плотности КН₂РО₄ и концентрации раствора. Зная оптическую плотность исследуемого раствора, по калибровочной кривой нужно найти концентрацию неорганического фосфора в исследуемых растворах. Определить температурный коэффициент Вант-Гоффа и рассчитать энергию активации.