Оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды

Оборудование

Термостат для температурного режима (37 ± 1) °C

Баня водяная с подогревом до температуры 100 ± 2 °C

Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом и устройство для создания разрежения (0,5 - 1,0) атм.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 1000 г и допустимой погрешностью ± 10 мг - ГОСТ 24104

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °C с ценой деления шкалы 0,5 °C

РН-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды - ГОСТ 6709

Стерилизатор суховоздушный для температурного режима (180 ± 5) °C

Автоклав или стерилизатор паровой - ГОСТ 19569

Холодильник, позволяющий поддерживать температуру +2 - 4 °C

Облучатель бактерицидный

Горелка газовая или спиртовая

Петли бактериологические

Пинцеты для работы с мембранными фильтрами

Пипетки градуированные 1-го и 2-го классов точности вместимостью 1 см³, 5 см³, 10 см³ - ГОСТ 29227

Пробирки ГОСТ 25336-82

Чашки бактериологические (Петри) - ГОСТ 23932-90

Допускаются к использованию коммерческие, питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации отечественного производства, а также зарубежных фирм, предназначенные для целей описываемых методов. Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29000. При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

Подготовка и обработка почвы для анализа

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный, плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Если проба почвы однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке. Затем почву распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг почвы.

Перед посевом почву просевают через сито диаметром 3 мм. При просеивании сито покрывают сверху стерильной бумагой. Почву дисперсную можно не подвергать просеиванию, почву торфяную, содержащую большое количество органических веществ, предварительно растирают в ступке. Неперегнившую растительную массу отбрасывают.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. В навеску почвы добавляют небольшое количество стерильной водопроводной воды до получения пастообразного состояния почвы, растирая ее в течение 5 минут. Из суспензии делают раститровку. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду в соотношении 1:9 к весу почвы (например: 1 г почвенной суспензии разводят в 9,0 см³ стерильной водопроводной воды, 10 г почвы - в 90,0 см³ воды и т.д.). После приготовления разведений применяют соответствующую предварительную обработку почвы в зависимости от типа и вида учитываемого микроорганизма. Основная цель, которую преследуем, проводя предварительную обработку почвы, заключается в том, чтобы извлечь клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц.

Основными приемами предварительной обработки почвы являются:

1) 10-минутное вертикальное встряхивание почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками - при навеске почвы 1 г;

2) 3-минутная обработка почвенной суспензии первого разведения на мешалке механического диспергатора - при навеске почвы более 1 г.

Почвенную суспензию, содержащую в 1,0 см³ 0,1 г почвы, через 30 секунд после предварительной обработки (за это время оседают грубые минеральные частицы) используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Дня этого из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 г (10¹) отбирают стерильной пипеткой 1,0 см³ и переносят в пробирку с 9,0 см³ стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 г/см³ (10²) почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001 - 0,00001 г/см³. (10⁴ - 10⁵). Для приготовления каждого разведения используют отдельные пипетки.

Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды, а также для учета численности микроорганизмов методом прямой микроскопии.