Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета БГКП в почве

При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 см³ на поверхность среды Эндо и немедленно равномерно распределять по поверхности шпателем. Посев при анализах сравнительно чистых почв производится из разведении от 1:10 до 1:1000, то есть от 10¹ до 10³. При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 10⁶. Посевы выращивают в термостате при (37 ± 1) °C в течение 24 ч. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению общих колиформных бактерий титрационным методом и подсчету количества колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножается на степень десятикратного разведения.

Определение энтерококков

Энтерококки - грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, с заостренными концами, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночными кокками. Полиморфны. При росте на жидких средах (ЛПС - лактозо-пептонная среда, ЩЭС - щелочно-полимиксиновая среда) вызывают диффузное помутнение и образование осадка.

Подготовка проб и приготовление разведений указаны выше.

Титрационный метод

Из разведений почвенной суспензии, прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10,0 см³ и засевают во флаконы с 50 см³ жидкой среды (ЛПС или ЩЭС). Посевы инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °C 24 ч. Из порции среды накопления, где отмечены признаки роста, производят высев петлей на одну из плотных сред (МИС - молочно-ингибиторная среда, ЖСТ - желточная среда Турчинского). Если через 24 ч признаки роста отсутствуют, посевы оставляют еще на сутки. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ.

Через 24 - 48 ч инкубации посевов на молочно-ингибиторной среде при температуре (37 ± 0,5) °C в качестве положительных результатов отмечают наличие аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском или сероватых, мелких колоний. Эта среда позволяет дифференцировать виды энтерококков: Е. faecalis образует аспидно-черные выпуклые колонии с металлическим блеском, Е. faecalis биовар liguefaciens - такие же колонии, окруженные зоной просветления, Е. faecium биовар durans - серые, мелкие, плоские колонии.

Для подтверждения наличия энтерококков делают микроскопию окрашенных по Граму мазков и каталазный тест. После выявления энтерококков устанавливают титр, при этом принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживаются колиформы. Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр. Так, при титре 0,01 индекс равен 100, а при титре 0,1 индекс равен 10.

Метод мембранных фильтров

Объем испытуемой пробы для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии в количестве от 5 до 50.

Выполнение анализа

Через мембранные фильтры профильтровывают 2 - 3 десятикратных объема испытуемой пробы. Фильтры с посевом помещают на азидную среду или среду ЖСТ и инкубируют при температуре 37 ± 0,5 °C в течение 24 - 48 часов.

Учет результатов на среде ЖСТ

Учет результатов на среде ЖСТ производят через 24 - 28 часов. Для учета выбирают фильтры, на которых выросло не более 20 - 30 колоний. Подсчитывают характерные для энтерококков колонии: плоские крупные с ровными краями, белые или бледноокрашенные с небольшим кремовым или розовым оттенком, а также малиновые. Последние образованы E. faecalis.

Если выросли колонии другого вида - выпуклые белые мелкие или ярко окрашенные, то их принадлежность к энтерококкам можно подтвердить по отсутствию каталазной активности и по характерной морфологии клеток при микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

Каталазный тест можно выполнить путем нанесения петлей капли 3%-ной перекиси водорода на подозрительные колонии. Более точно каталазный тест выполняют на предметном стекле, нанося петлей культуру и после подсушивания на воздухе добавляя каплю свежеприготовленной 3%-ной перекиси водорода и прикрывая покровным стеклом. Наличие пузырьков газа - положительный тест.

Учет результатов на азидной среде

Для учета выбирают фильтры, на которых выросло от 5 до 50 колоний.

Подсчитывают колонии, характерные для энтерококков: выпуклые, с ровными краями, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным нечетко оформленным центром.

Как правило, все колонии, которые растут на азидной среде, можно отнести к фекальным энтерококкам, имеющим индикаторное значение.

Очень мелкие (на пределе видимости невооруженным глазом), плоские разных оттенков колонии не учитывают.

При необходимости подтвердить наличие энтерококков по 2 - 3 колонии каждого типа микроскопируют после окраски по Граму.

При обнаружении в мазках грамположительных полиморфных диплококков дают положительный ответ.

Вычисление индекса энтерококков

Подсчитанное число колоний энтерококков суммируют и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.

Для расчета индекса количество колоний энтерококков суммируют, умножают на 1000 и делят на объем, профильтрованный через фильтры, на которых велся подсчет.