Классификация и характеристика тогавирусов

Семейство тогавирусов содержит 4 рода, два из которых - альфа-и флавивирусы являются арбовирусами. Последние характеризуются тем, что вызывают инфекции, передающиеся членистоногими, в основном кома­рами и клещами. Два других рода включают вирусы, не вызывающие трансмиссивных инфекций(рубивирусы и пестивирусы).

Род альфа - вирусов включает 21 серотип, типичным является ви­рус Синдбис.

Вирионы имеют сферическую форму с диаметром 70 нм. Тип симмет­рии кубический, икосаэдры. Имеют наружную липопротеидную оболочку, обладают гемагглютинирующими свойствами. Геном представлен однонитчатой линейной позитивной РЖ с м.м. около 4 млн.

Род флавирусов включает 41 серотип, почти все они размножаются в переносчиках. К этому роду относятся вирусы клещевого весенне-летнего энцефалита и омской геморрагической лихорадки, природные очаги которых имеются на территории нашей страны.

Вирионы имеют сферическую форму с диаметром 40-50 нм, тип сим­метрии кубический, имеют внешнюю липопротеидную оболочку, обладают гемагглютинирующими свойствами.

Геном представлен однонитчатой линейной позитивной РЖ с м.м. около 4,0 - 4,5 млн.

Известны две разновидности вируса клещевого энцефалита и соотвественно две формы болезни - более тяжелый дальневосточный клеще­вой энцефалит и более легкий европейский. Человек заражается при укусе клещей, а также алиментарным путем (через молоко инфицированного скота). Близким к вирусу клещевого энцефалита является вирус геморрагической омской лихорадки, заражение которой происходит так­же через укусы клещей.

Методы диагностики заболеваний, вызываемых альфа и флавивирусами

1.Заражение мышей внутрь мозга.

2.Заражение культур клеток (выраженный цитопатический эффект).

3.Использование иммунологических реакций для идентификации вирусов и определения антител к нему: реакция нейтрализации, реак­ция торможения гемагглютинации, РСК, иммунофлуоресцентный метод, иммунофэрментный и радиоиммунный методы.

ЗАНЯТИЕ 4

Дата_______________

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИИ

План занятия

I. Вирусологический диагноз гриппа (окончание):

а)вскрытие куриных эмбрионов зараженных вирусом гриппа. Определение наличия вируса гриппа в аллантоисноВ жидкости с помощью реакции гемагглютинации. Определение типа вируса с помощью РТГА.

2.Вирусологический диагноз полиомиелита (окончание):

а) регистрация роста вируса полиомиелита в клетках культуры ткани, цитопатический эффект;

б)цветная реакция.

3.Микробиологическая диагностика вирусных гепатитов (А,В,С,Е, дельта-гепатиты):

а) способы обнаружения вирусов,

б) использование иммунологи­ческих реакций. Методика "захвата" антител, относящихся к классу IgМ, для диагностики гепатита А. Применение реакции обратной пассивной гемагглютинации для обнаружения в сыворотке больных или носителей поверхностного антигена вируса гепатита В. Методика постановки РОПГА.

Методические указания

§ I. Вскрыть, соблюдая необходимые правила (см.занятие 3), куриный эмбрион и отсосать пастеровской пипеткой аллантоисную жид­кость. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяется с помощью реакции гемагглютинации вначале на стекле, а затем в пробирках (для определения титра вируса).

Реакция гемагглютинации обусловлена способностью ортомиксовирусов, имеющих гемагглютинин, взаимодействовать с мукопептидами оболочки эритроцитов ряда животных и птиц. В результате этого взаи­модействия происходит склеивание эритроцитов.Реакцию ставят в бак­териологических пробирках или на предметных стеклах. Для получения эритроцитов у петухов берут кровь из подкрыльцовой вены стерильным шприцем и дефибринируют в баночке с бусами. Эритроциты фильтруют через марлю, осаждают центрифугированием и трижды отмывают физио­логическим раствором. Из осадка эритроцитов готовят 1-2%-ную взвесь на физиологическом растворе. В пробирках готовят последовательные разведения вируса - 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. - в объеме I мл и добавляют равные объемы взвеси эритроцитов. Для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации в одну из пробирок эритроциты добавляют не к вирусной суспензии, а к физиологическому раствору. Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37⁰ на 30 мин. Учет реакции производят по форме осадка эритроцитов. Там, где прошла агглютинация, осадок эритроцитов напоминает развернутый зонт. Если агглютинации нет, эритроциты оседают на дно пробирки в вида круглого диска с ровными краями. То последнее разведение ви­руса, которое еще дает агглютинацию эритроцитов не менее, чем на 3+, носит название гемагглютинирующего титра вируса.

Поставить РТГА на стекле для определения типа вируса в аллантоисной жидкости (см.схему).

§ 2. О наличии и размножении вируса полиомиелита в клетках культуры тканей узнают по цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки ткани гибнут и под микроскопом обнаружи­ваются дегенеративные изменения. Клетки образуют симпласты, часто округляются и отторгаются пластами от стенок пробирки. В культуре ткани, не зараженной вирусами, под влиянием продуктов метаболизма клеток рН среды изменяется в кислую сторону и цвет индикатора ме­няется на желтый. Если в исследуемом материале имеется вирус полио­миелита, то клетки гибнут, рН среды меняется незначительно - среда сохраняет розовый цвет.

Рис.1 Определение типа вируса грипп с помощью реакции торможения гемагглютинации.

В каплю аллантоисной жидкости прибавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5%-ной взвеси эритроцитов.

Рис.2 ЦПЭ, вызванный вирусом полиомиелита в культуре ткани.

Рис.3 Бляшкообразование в культуре ткани, зараженной вирусом полиомиелита.

§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:

А. Для обнаружения вируса - заражение животных (обезьяны шимпанзе, мармозеты; электронная и иммуноэлектронная микроскопия.

Б. Для обнаружения антител к вирусу (или к его антигенам) иммунологические реакции: РСК, гемагглютинация иммунного прилипания, иммунофлуоресценция, иммуноферментный и радиоиммунный методы, реак­ция пассивной гемагглютинации и др.способы.

Наиболее специфичным методом диагностики гепатита А является использование иммуноферментного метода "захвата" антител класса IgМ. Суть метода. На стенках полистироловых луночек вначале адсорбируют антитела против IgM(анти-IgM, затем добавляют исследуемую сыворот­ку, в которой определяют наличие антител класса IgМ к вирусу гепатита А. Если они имеются, то образуется комплекс IgM- анти IgM. Далее добавляют специфический антиген (вирус гепатита А)-который связывается с противовирусными антителами. Для обнаружения образовавшегося комплекса добавляют противовирусные антитела; меченные ферментом (пероксидазой). После отмывания луночек в них добавляют субстрат для фермента (ортофенилендиамин) и определяют интенсивность образу­ющейся окраски. Схема.