Иммунодиагностические реакции и методы

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum – сыворотка и logos – учение), т.е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген – антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке или плазме крови больного антител против антигенов возбудителя или других антигенов (напр. онкологических маркеров), позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.

При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью диагностических сывороток, т.е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих антимикробные антитела.Это серологическая идентификациямикробов.

Для определения АТ или АГ применяют следующие реакции антиген-антитело и методы.

Реакция агглютинации (от лат. agglutination – склеивание) – склеивание корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов, др. частиц) антителами в присутствии электролитов (напр. изотонического раствора хлорида натрия).

РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул склеенных антителами. Ее используют для следующих целей:

– определение возбудителя, выделенного от больного;

– определение противомикробных и других АТ в сыворотке больного;

– определение группы крови.

РА может быть ориентировочная и развернутая.

Разновидности РА: РНГА, реакция Кумбса, РГА, РТГА, РОНГА.

Реакция непрямой гемагглютинации – выявление АТ сыворотки больного с помощью АГ-го эритроцитарного диагностикума (напр., ЭР с адсорбированными на них АГ).

Ставят в пластиковых планшетах, при положительной реакции ЭР выпадают в осадок в виде фестона – «зонтика». Отрицат. – «пуговка».

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – ЭР, на которых адсорбированы АТ. Такая реакция – обратной непрямой гемагглютинации – РОНГА.

Реакция Кумбса с неполными АТ (антирезусные): АТ + резус полож. ЭР + антиглобулиновая сыворотка (АТ против иммуноглобулинов человека) вызывает агглютинацию.

Реакция гемагглютинации используют для индикации и титрования вирусов, т.к. агглютинины вирусов склеивают ЭР. Ставят реакцию торможения гемагглютинации – РТГА. Она основана на подавлении АГ вирусов АТ-ми иммунной сыворотки, в результате вирусы теряют свойство агглютинировать ЭР.

Реакции преципитации (от лат. praecipito – осаждать) – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с АТ в виде помутнения, называемого преципитатом. Ее ставят в пробирках, в гелях, питательных средах.

Разновидности РП: кольцепреципитации (термопреципитации – реакция Асколи), двойной иммунодиффузии по Оухтерлони, радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез, реакция флокуляции, реакция нейтрализации.

Реакция связывания комплемента –при соответствии друг другу АГ и АТ они образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С), т.е. происходит его связывание. Если же комплекс антиген — антитело не образуется, то к— омплемент остается свободным .

РСКпроводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент;

2-я фаза (индикаторная) выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.

В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген — антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

Реакция радиального гемолиза ставят в лунках геля из агара, содержащего ЭБ и «С». После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза. Таким образом, можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела (Ат) взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз.

Реакция иммунного прилипания основана на активации системы «С» АГ-ми бактерий, вирусов, обработанными иммунной сывороткой. На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы для компонетов комплемента, благодаря чему при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, происходит их соединение.

Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса)- прямой, непрямой.

Прямая РИФ. Основана на том, что АГ тканей и МО, обработанные иммунными сыворотками с АТ, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучахлюминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямая РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью антиглобулиновой сыворотки (против первичных антител), меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают первичными антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами.

Иммуноферментный анализ (ИФА) – выявление АГ или АТ с помощью соответствующих им АТ или АГ, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой). К смеси добавляют субстрат, который расщепляется этим ферментом, и происходит изменение цвета среды. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ.

Радиоиммунный анализ (РИА) –высокочувствительный метод, основанный на реакции АГ-АТ с применением АГ или АТ меченных радионуклидом. После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивныйиммунный комплекс и определяют его радиоактивностьв соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивностьизлучения прямо пропорциональна количеству связавшихсямолекул антигена и антител.

Иммунная электронная микроскопия — электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорновольфрамовой кислотой или другими электроннооптически плотными препаратами.

Иммуноблотинг (ИБ) (или вестернблотинг) – метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем их переносят (блоттинг— от англ. blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски (стрипы) наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят

сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом.