Факторы, влияющие на эффективность изолирования «нелетучих» ядов из биоматериала
Эффективность изолирования веществ на I и II стадиях определяется рядом факторов.
На первой стадии на эффективность изолирования вещества будут влиять такие факторы, как:
1) Растворимость яда в используемом экстрагенте.
Поскольку на первой стадии используются полярные растворители (вода), яд должен находиться в водорастворимом (ионизированном) состоянии, т.е. кислоты и основания должны присутствовать в виде своих солей, а степень ионизации a ® 100%.
Необходимое для этого значение рН может быть рассчитано из уравнения степени ионизации Гендерсона. На практике пользуются более простым правилом. Для того, чтобы полностью перевести вещество в ионизированное состояние (a ® 100%), необходимо создать
рН = рКa + 2(3) для кислот и
рН = рКa - 2(3) для оснований
Отсюда очевидно, что для переведения кислот в ионизированное состояние (т.е. в их соли) нужна щелочная реакция среды. Так, если для барбитуратов рКa =7-8,, то рН = рКa + 2(3) = (7-8)+2(3) = 10 и выше.
Для оснований же требуется кислая реакция среды. Так, для атропина рН = рКa - 2(3) = 9,6 - 3 = 6,6 и ниже.
Слабоосновные алкалоиды нацело ионизированы уже в сильно кислой среде, например, для кофеина рН » 2,0 (рКa » 0,6)
Кислая реакция среды (рН»2) приводит, кроме того, к разрушению комплексов алкалоидов с белками, в виде которых они находятся в биологическом материале, что увеличивает выход алкалоидов. Влияние рН на эффективность изолирования «нелетучих» ядов особенно выражено при использовании в качестве экстрагента воды, т.к. этанол в большинстве случаев является хорошим растворителем и для ионизированной, и для молекулярной форм кислот и оснований.
2) Экстрагент
Кроме реакции среды, на степень изолирования в значительной мере влияет природа экстрагента, его количество, время и кратность экстракции.
К экстрагенту предъявляются следующие основные требования:
-Способность легко проникать в клетки тканей.
-Высокая растворяющая способность (по отношению к яду).
-Селективность (по отношению к анализируемым соединениям). Селективный растворитель в какой-то мере исключает загрязнение вытяжки балластными веществами - жирами, белками, пигментами и другими.
В большей мере этим требованиям отвечает вода, несколько в меньшей степени - спирт, который является почти универсальным растворителем для лекарственных веществ. Основным недостатком этанола является способность экстрагировать совместно с анализируемыми веществами нормальные компоненты биоматериала (белки, жиры, пигменты), что усложняет анализ, приводя к дополнительным методам очистки и потерям значительных количеств искомых веществ.
Количество экстрагента обычно берется вдвое больше по отношению к весу органов (1:2). Большие количества экстрагента, хотя и увеличивают эффективность экстракции, приводят к разбавлению извлечения и усложнению последующих операций, связанных с концентрированием веществ в извлечении.
Время экстракции определяется моментом наступления равновесия в концентрациях вещества между твердой и жидкой фазами, что устанавливается экспериментально (по прекращению прироста концентрации вещества в экстрагенте ). Для воды оно меньше (около 2 часов) по сравнению с этанолом (более 4-6 часов).
Кратность экстракции приводит к увеличению выхода вещества за счет поступления новых порций растворителя. Для извлечения искомых соединений из внутренних органов возможны такие способы, как однократная и многократная экстракция, т.к. непрерывная экстракция требует специальной аппаратуры.
3) Немаловажную роль в экстракции играет и степень измельченности объекта, что обеспечивает максимальный доступ растворителя к искомому веществу (площадь соприкосновения твердой и жидкой фаз), но одновременно увеличивает количество соэкстрактивных веществ.
Вторая стадияизолирования «нелетучих» ядов заключается в выделении их из водного извлечения путем экстрагирования органическим растворителем, не смешивающимся с водой, при различных значениях рН среды. Этим достигается концентрирование вещества в извлечении и его частичная очистка от нормальных компонентов биоматериала (не растворимых в данном растворителе).
За счет экстрагирования веществ вначале из кислого, а затем из щелочного водного раствора, их можно разделить на 2 подгруппы:
1) Вещества, экстрагируемые органическими растворителями из кислого раствора (вещества кислотного, нейтрального и частично слабоосновного характера).
2) Вещества, экстрагируемые из щелочного раствора (вещества основного и частично слабоосновного характера).
Вещества со слабо выраженными основными свойствами могут частично перераспределяться из одной подгруппы в другую. К ним относятся производные пурина - кофеин, теобромин, теофиллин; опийные алкалоиды - папаверин, наркотин,; производные индола - бруцин, стрихнин; стероидоподобный алкалоид - вератрин, некоторые синтетические лекарственные средства - антипирин, амидопирин, промедол, производные фенотиазина (аминазин ) и др.
Для веществ нейтрального характера, не способных к ионизации, практически не требуется создания определенного значения рН, т.к. они экстрагируются органическим растворителем в молекулярной форме из любой среды. Разделение веществ на 2 подгруппы в значительной степени облегчает проведение последующего ненаправленного анализа с целью обнаружения неизвестного яда.
На второй стадии изолирования продолжают играть свою роль уже рассмотренные выше факторы, такие, как
1) растворимость яда, которая определяется степенью ионизации a и регулируется рН среды.
2) природа экстрагента, его объем, время и кратность экстракции.
Если на первой стадии изолирования веществ данной группы мы стремились перевести их в ионизированное состояние и сделать водорастворимыми, то на второй стадии наша задача заключается в том, чтобы перевести вещества в неионизированную (молекулярную) форму (a®0), которая хорошо экстрагируется из водной фазы неполярным органическим растворителем. Необходимое для этого значение рН может быть рассчитано из уравнения, имеющего следующий вид:
рН = рКa - 2(3) для кислот
рН = рКa + 2(3) для оснований
Понятно, что для веществ кислого характера на этой стадии требуется создание кислой среды, а для основных – щелочной.
В качестве экстрагентов веществ из водной фазы подбирают неполярные органические растворители, которые:
а) не смешиваются с водой и по удельному весу (d) значительно отличаются от нее, что предотвращает образование эмульсий в процессе экстрагирования (d¹1,0)
б) имеют низкую температуру кипения, что облегчает их упаривание из экстракта
в) хорошо растворяют изолируемое вещество и обеспечивают высокий коэффициент распределения его между водной и органической фазами (Кр = С0/Св)
Коэффициент распределения можно увеличить, добавив в водную фазу электролит, который способствует вытеснению вещества из водной фазы в слой органического растворителя за счет понижения его растворимости в воде (разрушение сольватной оболочки молекул). В качестве электролита используют Na2SO4, (NH4)2SO4, NaCl.По данным проф. В.Ф.Крамаренко, наиболее подходящим электролитом при изолировании алкалоидов является сульфат аммония.
Наличие электролита в водной фазе приводит также к осаждению белков, что служит своеобразной очисткой полученного извлечения. Избыточное количество электролита, особенно при изолировании соединений кислотного характера, может привести к значительным потерям искомых веществ за счет их осаждения.
Исходя из перечисленных выше требований, наиболее подходящим экстрагентом для веществ кислотного характера является эфир, а для веществ основного характера - хлороформ.
Объем экстрагента, время и кратность экстракций.
Необходимый объем экстрагента при однократной экстракции можно рассчитать , исходя из уравнения степени экстракции (Е)
100 * Кр
Е = ---------------------- %, где
Кр + uН2О/uорг
Кр - коэффициент распределения
uН2О - объем водной фазы
uорг - объем органической фазы
Время экстракции обычно не превышает 5 минут, т.к. экспериментально доказано, что за этот период времени большинство органических соединений переходит из водной в органическую фазу.
Кратность экстракции обычно составляет 2-3, что обеспечивает полноту извлечения вещества за счет поступления свежих порций растворителя.