Clostridium difficile - возбудитель псевдомембранозного колита
Факторы патогенности C.difficile, свойства комплексного токсина.Обладает адгезивной активностью и продуцирует комплексный термолабильный токсин, который состоит из энтеротоксина (токсин А) и цитотоксина (токсин В). Токсин А –-- на гуанилатцикзную систему, стимулируя образование цГМФ --- диарея. Токсин В – ингибирует синтез белка --- нарушается ф-ция клеточных мембран --- потеря калия (обладает сильным летальным д-ем).
Патогенез псевдомембранозного колита. Условия, способствующие развитию заболевания.Попадает в ЖКТ, развивается на фоне лечения а/б. Ослабленное а/б нормальная микрофлора толстого кишечника создает благоприятные условия для адгезии и колонизации эпителия штаммами C.difficile. Образуется комплексный токсин --- развитие язвенного пленчатого колита с диарейными проявлениями и кровью в испражнениях --- слизистая толстого кишечника некротизируется, покрывается лейкоцитами и налетом фибрина.
Источник и пути заражения псевдомембранозным колитом. Клинические проявления заболевания.Находится в почве, воде, в кишечнике животных и чел-ка, причем часто обнаруживается в кишечнике у детей (особенно новорожденных). Возникает при употреблении инфицированной пищи, но в основном – это ВБИ с контактно-бытовым способом заражения. Клиника – см. выше.
Исследуемые материалы и методы микробиологической диагностики псевдомембранозного колита.Материалы: испражнения, рвотные массы, подозрительные пищевые продукты. Методы исследования: 1) бактериологический – выделение и идентификация возбудителя, выделенного от больного и из пищевого продукта; 2) серологический – определение токсинов серотипов А или В с помощью ИФА и встречного иммуноэлектрофореза.
ВИРУСОЛОГИЯ.
Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток.Под цитопатическим действием понимают совокупность морфологических и функциональных (в том числе биохимических) изменений в клетках, возникающих под влиянием внедрившегося вируса. Более выражена реакция клеток при острой вирусной инфекции. Предполагается, что основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведет к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые и вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД. Цитопатическое действие вируса на монослой клеток учитывают по четырехкрестовой системе: "++-Н-" - полная гибель клеточной культуры; "+++" - клеточный слой отсутствует, но имеются единичные клетки, не пораженные вирусом; "++" -дегенеративные изменения наблюдаются у 50% клеточной культуры; "+" - дегенеративным изменениям подверглись отдельные клетки монослоя, главным образом в краевых участках. ЦПД включает: 1) Симпластообразование. 2) Включения. К проявлению цитопатического действия вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. 3) Латентнаявирусная инфекция. 4) Трансформация клеток наступает при заражении клеточной культуры онкогенными вирусами, под действием которых клетки начинают безудержно делиться и располагаются не монослоем, а растут беспорядочно в несколько слоев. 5) Индикация вируса по его цитопатическому действию – с целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. 6) Титрование вирусов по цитопатическому действию. Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине зараженных культур. 7) Идентификация выделенного вируса по нейтрализации ЦПД. В иру ее о держащим материалом, подлежащим
идентификации, обычно служит культуральная жидкость из пробирок с клеточной культурой, давших ЦПД при заражении исследуемым материалом.
Титрование вируснейтрализующих антител в сыворотке больного. Готовят двукратные последовательные разведения исследуемой сыворотки и смешивают каждое из них со стандартной дозой известного вируса (100, 1000 ЦПД50), после 1-2-часового контакта смесью заражают клеточные культуры. Титром сыворотки называется то наибольшее разведение, которое полностью подавляет ЦПД вируса в половине взятых в опыт культур (т.е. в 2 пробирках из 4, на которых проверяют; каждое разведение сыворотки).
Реакция гемадсорбции.Гемадсорбцией называется способность культур клеток, зараженных некоторыми вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Приобретение способности к гемадсорбции связано в встраиванием в мембрану зараженных вирусом клеток (в участках будущего "почкования" вирусов) вирусспецифических белков - гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности зараженных клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека О (I) группы. Обнаружение вируса в реакции гемадсорбции.По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно. Латентную инфекцию культур клеток могут вызывать аденовирусы, парагриппозные, вирус герпеса и др. Техника постановки реакции гемадсорбции. Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом по описанной выше методике. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней). Для этого в пробирку с зараженной культурой (иногда предварительно удалив среду) вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4%-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем. Далее пробирки слегка встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания не ад сорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малым увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов. При положительной гемадсорбции скопления эритроцитов на клетках могут быть весьма характерными. Вирус гриппа дает гемадсорбцию островкового типа: парагриппозные вирусы - диффузного; для поксвирусов характерным является расположение эритроцитов вокруг клеток в виде венчика или ожерелья. Реакция гемадсорбции наиболее часто применяется для раннего обнаружения парагриппозных вирусов в носоглоточных смывах больных. Реакцию применяют также и для титрования вирусов и выявления специфических антител.
Идентификация вирусов в реакции задержки гемадсорбции. Было обнаружено, что при добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно зараженной соответствующим вирусом, зараженные клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления, реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.
Метод бляшек.(1 вирусная частица = 1 бляшка).Бляшками называются округлые участки разрушенных по действием вируса клеток однослойной культуры. Это своеобразные "негативные колонии" вирусов, образовавшиеся на месте попадания одного вириона.
Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель - нейтральный красный. В таких условиях ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен.
Одним из первых были получен бляшки вирусов полиомиелита в однослойной культуре клеток, выращиваемой в чашках Петри с подачей стерильного воздуха с 3% СО2 (Дюльбекко, 1962г.)
Обнаружение и титрование вирусов методом бляшек.Для получения бляшек вирусов во флаконы или чашки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина). Флаконы закрывают резиновыми пробками, чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на 5-6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплошным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток
осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно отсасывают. Заражение производят путем внесения разведенного исследуемого материала в объеме 0,1-0,25 мл равномерного распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с
помощью покачивания. Через 30-60 минут зараженную культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашки с застывшей средой помещают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2-5 суток), после
чего производят их подсчет и изучение. Существует пропорциональная зависимость между разведением вируссодержащего материала и количеством образовавшихся бляшек, позволяющая считать, что каждая бляшка образуется в результате размножения в клетках одного вириона.
Способность к образованию бляшек в настоящее время обнаружена у многих вирусов: полиомиелита, Коксаки, ECHO, энцефалита, гриппа, кори и ряда других.
При изучении морфологии бляшек установлено, что разные вирусы, как правило, образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краев, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса.
Наиболее часто метод бляшек применяют для титрования вирусов. Для этой цели приготовляют серийные разведения вирусе од ержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки (с учетом разведения вируса) вычисляют титр вируса - количество вирионов в 1,0 мл, исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.
Идентификация вирусов и титрование антител.Метод бляшек дает возможность провести точную идентификацию вируса с помощью диагностических специфических сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается. Благодаря своей чувствительности и точности метод приобрел большое значение в изучении тонких антигенных различий у вирусов. С помощью метода бляшек удается также обнаружить антитела в сыворотке больных и определить их титр, что имеет диагностическое значение. За титр сыворотки принимают ее наибольшее разведение, снижающее количество бляшек на 50%.
Цветная проба.Цветная проба (или цветная реакция) основана на разнице в цвете среды с индикаторам фенолрот, в которой растет нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, зараженная вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда о индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет(исходное значение рН 7,4-7,6), вследствие снижения рН до 7,0-6,8 приобретает желтый цвет. Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: происходит подавление процессов метаболизма, значительно понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остается на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остается красного цвета. Так, по сохранению красного цвета среды или переходу его в желтый можно судить о наличии или отсутствии вируса в исследуемом материале, внесенном в культуру клеток. С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры. Поэтому клетки продолжают нормально жить и размножаться, что приводит к переходу среды в желтый цвет. Цветная проба получила широкое применение в диагностике полиомиелита при инфекциях, вызываемых вирусами Коксаки А и В. ECHO, аденовирусами и некоторыми арбовирусами. Оценка результатов цветной пробы проводится по изменению цвета среды через определенный срок культивирования клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, о которой ставят реакцию, имеет определенный уровень метаболизма. Поэтому постановке цветной пробы обязательно предшествует определение метаболической активности клеток культуры, о которой собираются ставить цветную реакцшо. Устанавливают так называемую дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку. Определение дозы клеток. При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-120 тыс. в 1 мл. Из нее делают ряд возрастающих двукратных разведении в объеме 0,25мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среди из красного в желтый на 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза - 25 тыс. клеток в объема 0,25 мл. На воспроизводимость результатов цветной пробы, кроме типа применяемых клеток и их концентрации, влияют также состав, буферность, рН питательной среды. Титром вирусапо цветной пробе называется то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл.5) титр вируса равен 10"4 (две пробирки красные, две - желтые). Количество вируса, содержащееся в объеме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД50) вируса.
Гемагглютинация, вызываемая вирусами, не является иммунологической реакцией, так как здесь нет системы антиген - антитело. С помощью этой реакции легко выявить присутствие гемагглютинирующего вируса, но невозможно его идентифицировать. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, имеют на поверхности гемагглютинины, с помощью которых и происходит склеивание эритроцитов. По своей химической природе гемагглютинины являются глико- или липопротеидами. У сложных вирусов они структурно связаны с ворсинками, у простых вирусов - с капсидом. В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элюции. Адсорбция вирусов на эритроцитах начинается как неспецифическая, а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов. На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия - гемагглютинацид, на которой процесс может остановиться. Некоторые вирусы способны к элюции - освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов. При постановке реакции гемагглютинации (РГА) стараются использовать именно те эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса выявляются лучше; -чаще всего гемагглютинацию ставят с эритроцитами кур. Обычно РГА ставят при комнатной температуре, реже при 4° или 37 С. Необходимо также учитывать значение рН, электролитный состав среды. Задерживающее действие на РГА могут оказать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах. Для снятия ингибиторного действия виру с со держащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др. Применение.Реакция гемагглютинации широко применяется в вирусологической практике для обнаружения гемагглютинирующих вирусов и их титрования. Реакция проста но технике выполнения, дает быстрые и достаточно точные результаты. Наиболее часто РГА применяют при диагностике гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций. Используют ее и для обнаружения ряда других вирусов, обладающих гемагглютинирующими свойствами. В научных исследованиях РГА является удобной моделью для изучения механизма взаимодействия вируса и клетки. Обычно реакцию гемагглютинации ставят на плексигласовых досках с углублениями - луночками, реже - в пробирках или на предметных стеклах.
Техника постановки РГА.На плексигласовой доске готовят двукратные возрастающие разведение в объеме 0,5 мл исследуемого вируссодержащего материала, начиная с 1:10 и до 1:1280. В луночки с разведениями добавляют равные объемы 1% взвеси эритроцитов кур (предварительно трехкратно отмытых физиологическим раствором). Доску осторожно встряхивают и оставляют на 30-45 мин при комнатной температуре. Учет результатов проводят по трехкрестовой системе в зависимости от внешнего вида осадка эритроцитов. При гемаггдютинации на "++" осадок имеет форму зонтика и занимает все дно лунки. При отсутствии агглютинации эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска. Титром вирусаназывается то наибольшее его разведение, при котором еще наблюдается выраженная гемагглютинация ("+++" или "++"), В нашем примере титр вируса 1:320, Количественное содержание вируса в разведении, равном титру, называется гемаглютинирующей единицей (содержится в 0,5 мл разведения 1:320). Определение этой величины необходимо для постановки реакции торможения гемагглютинации, в которой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие единицы.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).Если предварительно соединить вирус со специфической иммунной вируснейтрализующией сывороткой и уже потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус теряет способность вызывать гемагглютинацию. Таким образом, вируснейтрализующая сыворотка оказыает тормозящее действие на реакцию гемагглютинации, и по отсутствию или наступлению РГА можно судить о том, произошла ли реакция нейтрализации между вирусом и сывороткой. Эта реакция получила название реакции торможения гемагглютинации (РТГА), она обладает иммунологической специфичностью и может быть использована: а) для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинируюшего вируса - по специфической диагностической сыворотке; б) для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного - по известным вирусным антигенам-диагностикумам.
Ингибиторы.Затрудняет применение РТГА наличие в сыворотках крови человека и животных неспецифических вирусных ингибиторов, которые могут вызвать неспецифическое торможение гемагглютинации. Чтобы избежать искажения результатов РТГА, выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденые от ингибиторов.
При постановке РТГА с сыворотками больных следует пользоваться специальными ингибиторорезистентными вирусными диагностикумами или же освобождать сыворотки от ингибиторов путем прогревания при температуре 56-60°С, обработки нейраминидазой, трипсином, ацетоном, адсорбции ингибиторов каолином и т.п.
Реакцию торможения гемагглютинации ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА. Основное отличие состоит в том, что в реакция наряду с вирусом и эритроцитами участвует еще сыворотка, с которой вирус предварительно выдерживают, и уже потом добавляют эритроциты.
Парные сыворотки. Обычно при серологической диагностике вирусных заболеваний исследуют так называемые парные сыворотки, т.е. сыворотки, взятые у больных двукратно: в начале и ближе к концу заболевания. Это позволяет не только обнаружить антитела (их присутствие далеко не всегда говорит об имеющейся инфекции), но и выявлять повышение их титра в точение болезни, что имеет основное значение яри установлении диагноза. Обе парные сыворотки исследуют одновременно, нарастание титра антител в четыре раза и более указывает на перенесенную вирусную инфекцию. В вирусологической практике многие серологические реакции ставят с малыми объемами антигенов и антител (например, по 0,01 мл) - в виде микрометодов. Это позволяет более экономично расходовать дорогостоящие ингредиенты реакции и особенно высокоочищенные антигены. Точность реакции и быстроту постановки обеспечивает применение автоматических микропипеток и мерных петель
Реакция нейтрализации in vivo.Реакция нейтрализации вирусов высоко специфична, она широко применяется для установления диагноза вирусных инфекций, а также для титрования коммерческих препаратов противовирусных иммунных сывороток и иммуноглобулинов. Реакция нейтрализации основана на способности иммунной вируснейтрализующей сыворотки при контакте с вирусом подавлять его инфекционные свойства, что выявляется при введении смеси в чувствительную биологическую систему (мыши, куриные эмбрионы, клеточная культура). Основными составляющими компонентами этой реакции являются: иммунная вирус нейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека: содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном, и биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постояшгую дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором - постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Первый вариант используют, когда необходимо установить, при каком разведении вируса наступает нейтрализующее действие сыворотки. Второй вариант выявляет нарастание титра антител. Сыворотки, употребляемые для реакции нейтрализации. получают либо от больных людей (для обнаружения антител и нарастания их титра), либо применяют диагностические сыворотки от иммунизированных животных (для идентификации возбудителя). Перед постановкой реакции сыворотки, как правило, инактивируют, прогревая при температуре 56 - 60 С. Антигены (вирусосодержащие взвеси) получают из материала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей зараженных вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности. Биологические объекты, употребляемые в реакции нейтрализации являются той средой, в которой проявляется нейтрализующее вирус действие иммунной сыворотки. Поэтому выбор того или иного объекта производится о учетом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования. В качестве биологических объектов используют лабораторных животных, чаще всего белых мышей, куриные эмбрионы, а также культуры клеток. Реакция нейтрализации на белых мышах (1 вариант). За зараженными животными (опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учет реакции проводят путем сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50 % смертельную дозу - LD5o, проводя подсчет по Риду и Менчу. Высчитывают индекс нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой. II вариант (на мышах и куриных эмбрионах). Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и достоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объемы определенного разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD5o вируса). Далее поступают как и в 1-м варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам. При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей. В реакции на куриных эмбрионах титром сыворотки считается то наибольшее ее разведение, которое еще способно задерживать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% зараженных куриных эмбрионов.
Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов).Данный метод основан на способности двухспиралъной ДНК к денатурации и рснатурации. Денатурация- это расхождение цепей при нагревании ДНК до 80° - 100°с или обработке ее щелочью. Реставрация - воссоединение цепей с помощью водородных связей при снижении температуры до 40° - 60° (так называемый отжиг) и приобретение ДНК первоначальной двухспиралъной структуры. Разъединенные цепи ДНК способны к гибридизации с фрагментами других однослиральных ДНК, имеющих комплементарные участки расположения нуклетидов. К гибридизации комплементарных нитей способна также РНК, образуя комплексы ДНК - РНК или РНК - РНК. При постановке реакции молекулярной гибридизации зонды метят радиоактивной (Pj3), флюоресцентной или биотиновой меткой, соединяют с исследуемым материалом, содержащим определяемую нуклеиновую кислоту, подвергшуюся денатурации. Если зонд (фрагмент вирусного генома) комплементарен цепи определяемой нуклеиновой кислоты, происходит гибридизация в комплементарном участке. После отжига зонд оказывается включенным в ренатурированную нуклеиновую кислоту и может быть обнаружен по имеющейся метке. Выявление наступившей молекулярной гибридизации позволяет установить природу определяемого вируса. Этот метод применяют в первую очередь для определения в клиническом материале персистирующих вирусов, при латентной вирусной инфекции, для выявления вирусов, которые не удается культивировать в культуре клеток.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК).Полимеразная цепная реакция основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарности цепей ДНК. Новым важным принципом реакции является использование термо стабильной ДНК-пол им еразы, при участии которой происходит амплификация - умножение определяемых генов (вирусных, бактериальных) или их фрагментов с определенной нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительной количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Именно на амплификации генов или их фрагментов основана "сверхчувствительность" этой реакции. В реакции участвуют следующие ингредиенты: 1) определяемая ДНК вирусов или других инфекционных агентов; 2) праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды); 3) свободные нуклеотиды; 4) фермент термостабильная ДНК - полимераза.Сущность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящаяся в тестируемом биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их комплементарности, к 3' концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат "затравками" для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цеди свободные нуклеотиды. В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается (из одной матрицы ДНК образуется две копии), то есть происходит амплификация ДНК. Метод особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекпии. ПЦР применяют также при диагностике холеры (обнаруживают ген, детерминирующий синтез энтеротоксина у холерного вибриона), бруцеллеза, легионеллеза, микобактериозов и других инфекций.