Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Применение в определенной последовательности ряда перечисленных мето-

дов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный,

однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от

низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы

диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диа-

лизе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная

пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как

правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомо-

лекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической

точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при мед-

ленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических

белков *. Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным,

поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония

могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекуляр-

ных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтра-

ции. Последняя основана на продавливании растворов белка через спе-

циальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не

только освободить белковые растворы

Определение гомогенности белков

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя

всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. достоверные результаты при определении

гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности

сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле,

изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение

растворимости белка.

Хромопротеины. Структура гема.

К группе гемопротеинов относятся гемоглобин и его производные, миогло-

бин, хлорофиллсодержащие белки и ферменты (вся цитохромная система,

каталаза и пероксидаза). Все они содержат в качестве небелкового компо-

нента структурно сходные железо- (или магний)порфирины, но различные

по составу и структуре белки, обеспечивая тем самым разнообразие их

биологических функций. Далее более подробно рассмотрено химическое

строение гемоглобина, наиболее важного для жизнедеятельности человека

и животных соединения.

Гемоглобин в качестве белкового компонента содержит глобин, а не-

белкового – гем. Видовые различия гемоглобина обусловлены глобином,

в то время как гем одинаков у всех видов гемоглобина.

Основу структуры простетической группы большинства гемосодержа-

щих белков составляет порфириновое кольцо, являющееся в свою очередь

производным тетрапиррольного соединения – порфирина. Последний со-

стоит из четырех замещенных пирролов:

соединенных между собой метиновыми мостиками (—СН=). Незамещен-

ный порфирин называется порфином. В молекуле гема порфин представлен

в виде протопорфирина IX, содержащего четыре метильные группы

(—СН3), две винильные группы (—СН=СН2) и два остатка пропионовой

кислоты. Протопорфирин, присоединяя железо, превращается в гем.

ФОСФОПРОТЕИНЫ

К белкам этого класса относятся казеиноген молока, в котором содержание

фосфорной кислоты достигает 1%; вителлин, вителлинин и фосвитин,

выделенные из желтка куриного яйца; овальбумин, открытый в белке

куриного яйца; ихтулин, содержащийся в икре рыб, и др. Большое коли-

чество фосфопротеинов содержится в клетках ЦНС. Фосфопротеины зани-

мают особое положение в биохимии фосфорсодержащих соединений не

только в результате своеобразия структурной организации, но и вследствие

широкого диапазона функций в метаболизме. Характерной особенностью

структуры фосфопротеинов является то, что фосфорная кислота оказы-

вается связанной сложноэфирной связью с белковой молекулой через

гидроксильные группы β-оксиаминокислот, главным образом серина

и в меньшей степени треонина. На одну молекулу белка обычно приходится

2–4 остатка фосфата.

Новые данные свидетельствуют о том, что в клетках фосфопротеины

синтезируются в результате посттрансляционной модификации, подвер-

гаясь фосфорилированию при участии протеинкиназ. Этот процесс под-

робно рассматривается в главе 14. Здесь лишь укажем на существенную

роль специфической протеинкиназы, катализирующей фосфорилирование

ОН-группы тирозина, в биосинтезе онкобелков. Таким образом, уровень

фосфопротеинов в клетке зависит в значительной степени от регулирую-

щего действия ферментов, катализирующих фосфорилирование (протеин-

киназы) и дефосфорилирование (протеинфосфатазы). Следует отметить, что

фосфопротеины содержат органически связанный, лабильный фосфат, аб-

солютно необходимый для выполнения клеткой ряда биологических функ-

ций. Кроме того, они являются ценным источником энергетического и

пластического материала в процессе эмбриогенеза и дальнейшего постна-

тального роста и развития организма.

Особо следует отметить, что некоторые ключевые ферменты, регули-

рующие процессы внутриклеточного обмена веществ, также существуют

как в фосфорилированной, так и в дефосфорилированной форме. Этим

подчеркивается значение фосфорилирования–дефосфорилирования в про-

цессах химической модификации макромолекул, участвующих в интеграль-

ных процессах метаболизма.

ЛИПОПРОТЕИНЫ

Этот класс сложных

белков состоит из белка и простетической группы, представленной каким-

либо липидом.

Хиломикроны состоят преимущественно из триглицеридов, причем, как мы знаем, из экзогенных триглицеридов, транспортной формой в крови которых они и являются.

Липопротеины очень низкой плотности также главным образом содержат триглицериды, но эндогенного происхождения и являются их транспортной формой в крови.

Липопротеины низкой плотности в своем составе в норме содержат до 45% холестерина, что преобладает над другими типами липидов в данном классе липопротеидов, поэтому данные липопротеины рассматривают как транспортную форму холестерина в крови.

Липопротеины высокой плотности содержат больше всего фосфолипидов и являются их транспортной формой.

В крови здорового человека, взятой натощак, содержатся только липопротеиды высокой, низкой и очень низкой плотности. Хиломикроны в ней отсутствуют. Они появляются только при нарушениях липидного обмена.

В ряде патологических состояний в крови может обнаруживаться пятый класс липопротеинов — липопротеиды промежуточной плотности. Обычно они представляют собой промежуточные продукты превращения липопротеинов очень низкой и низкой плотности. Синтезируются липопротеиды высокой и очень низкой плотности в печени, а низкой — в плазме крови из липопротеидов очень низкой плотности.

Все классы липопротеидов в большей или меньшей мере содержат холестерин. Но наиболее атерогенными из них являются ЛПНП и ЛППП. Един­ственный неатерогенный класс липопротеидов — это липопротеиды высокой плотности. Более того, они активно участвуют в выведении холестерина из клеток путем этерификации его, что облегчает доставку холестерина в печень, откуда он в составе желчи выводится в кишечник и удаляется из организма. Все другие классы, наоборот, транспортируют холестерин в клетки.

Кроме того, липопротеиды высокой плотности являются транспортной формой фосфолипидов в крови. Фосфолипиды способствуют поддержанию холестерина во взвешенном состоянии, препятствуя его выпадению из кровяного русла.

ГЛИКОПРОТЕИНЫ

Гликопротеины– сложные белки, содержащие, помимо простого белка или

пептида, группу гетероолигосахаридов. В состав гликоконъюгата входит угле-

водный компонент (гликановая фракция), ковалентно связанный с неугле-

водной частью (агликановая фракция), представленной белком, пептидом,

аминокислотой или липидом.

МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ

К металлопротеинам относятся биополимеры, содержащие, помимо белка,

ионы какого-либо одного металла или нескольких металлов (табл. 2.5).

К таким белкам принадлежат, например, белки, содержащие негемовое

железо, а также белки, координационно связанные с атомами металлов

в составе сложных белков-ферментов.

Амфотерность.

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных

NH2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований.

В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных

аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положитель-

ный заряд, переемещаясь к аноду или катоду.

Мононуклеотид.

структурными единицами нуклеиновых кислот являются

мономерные молекулы – мононуклеотиды.

Полиморфизм белков.

У разных особей возникают варианты (мутации) разных генов или варианты одного и того же гена. Варианты генов, образующиеся у отдельных особей, могут постепенно распространяться в популяции в результате наследования, если они не летальны. Так формируется генотипическая неоднородность популяции, которая ведет и к фенотипической неоднородности. На молекулярном уровне фено-типическая неоднородность проявляется как полиморфизм белков — существование разных форм белка, выполняющих одинаковые или очень сходные функции (изобелки)

Два белка – гемоглобин1 и миоглобин – часто называют дыхательными ферментами (рис. 1). Оба этих вещества выполняют роль переносчиков при дыхании: гемоглобин – основной компонент красных кровяных телец2 (эритроцитов), переносящих по артериям кислород из легких к тканям; миоглобин – красный белок в мышцах, принимающий кислород от гемоглобина и хранящий его там до того момента, когда он потребуется для окисления пищевых веществ. Эти процессы в организме сопряжены с одновременным переносом углекислого газа, переправляемого из тканей в легкие, в основном в виде бикарбоната. Перенос бикарбоната и углекислого газа идет также при содействии гемоглобина.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Белки выполняют множество самых разнообразных функций, характерных

для живых организмов, с некоторыми из которых мы познакомимся более

подробно при дальнейшем изучении курса. Ниже рассматриваются главные

и в некотором смысле уникальные биологические функции белков, несвой-

ственные или лишь частично присущие другим классам биополимеров.

Каталитическая функция.К 1995 г. было идентифицировано более

3400 ферментов. Большинство известных в настоящее время ферментов,

называемых биологическими катализаторами, является белками. Эта функ-

ция белков, хотя и не оказалась уникальной, определяет скорость химиче-

ских реакций в биологических системах *.

Транспортная функция.Дыхательная функция крови, в частности перенос

кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина – белка эритроцитов.

В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови.

Ряд других сывороточных белков образует комплексы с жирами, медью,

железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая

их доставку в соответствующие органы-мишени.

Защитная функция.Основную функцию защиты в организме выполняет

иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных

белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов,

вирусов или чужеродных белков. Высокая специфичность взаимодействия

антител с антигенами (чужеродными веществами) по типу белок-белковое

взаимодействие способствует узнаванию и нейтрализации биологического

действия антигенов. Защитная функция белков проявляется и в способности

ряда белков плазмы крови, в частности фибриногена, к свертыванию.

В результате свертывания фибриногена образуется сгусток крови, предохра-

няющий от потери крови при ранениях.

Сократительная функция.В акте мышечного сокращения и расслабления

участвует множество белковых веществ. Однако главную роль в этих

жизненно важных процессах играют актин и миозин – специфические белки

мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным

белкам, но и белкам цитоскелета, что обеспечивает тончайшие процессы

жизнедеятельности клеток (расхождение хромосом в процессе митоза).

Структурная функция.Белки, выполняющие структурную (опорную)

функцию, занимают по количеству первое место среди других белков тела

человека. Среди них важнейшую роль играют фибриллярные белки, в част-

ности коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже,

эластин в сосудистой стенке и др. Большое значение имеют комплексы

белков с углеводами в формировании ряда секретов: мукоидов, муцина

и т.д. В комплексе с липидами (в частности, с фосфолипидами) белки

участвуют в образовании биомембран клеток.

Гормональная функция.Обмен веществ в организме регулируется разно-

образными механизмами. В этой регуляции важное место занимают гормо-

ны, синтезируемые не только в железах внутренней секреции, но и во

многих других клетках организма (см. далее). Ряд гормонов представлен

белками или полипептидами, например гормоны гипофиза, поджелудочной

железы и др. Некоторые гормоны являются производными аминокислот.

Питательная (резервная) функция.Эту функцию выполняют так назы-

ваемые резервные белки, являющиеся источниками питания для плода,

например белки яйца (овальбумины). Основной белок молока (казеин)

также выполняет главным образом питательную функцию. Ряд других

белков используется в организме в качестве источника аминокислот, кото-

рые в свою очередь являются предшественниками биологически активных

веществ, регулирующих процессы метаболизма.

Можно назвать еще некоторые другие жизненно важные функции бел-

ков. Это, в частности, экспрессия генетической информации, генерирование

и передача нервных импульсов, способность поддерживать онкотическое

* Получены экспериментальные доказательства, что, помимо белков, ферментативной,

каталитической активностью наделен и ряд других макромолекул, в частности РНК (названы

рибозимами) и моно- и поликлональные антитела (абзимы) – см. главу ≪Ферменты≫.

давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физио-

логическое значение рН внутренней среды, и др.

Таким образом, из этого далеко не полного перечня основных функций

белков видно, что указанным биополимерам принадлежит исключительная

и разносторонняя роль в живом организме. Если попытаться выделить

главное, решающее свойство, которое обеспечивает многогранность биоло-

гических функций белков, то следовало бы назвать способность белков

строго избирательно, специфически соединяться с широким кругом разно-

образных веществ. В частности, эта высокая специфичность белков (срод-

ство) обеспечивает взаимодействие ферментов с субстратами, антител

с антигенами, транспортных белков крови с переносимыми молекулами

других веществ и т.д. Это взаимодействие основано на принципе биоспе-

цифического узнавания, завершающегося связыванием фермента с соответ-

ствующей молекулой субстрата, что содействует протеканию химической

реакции. Высокой специфичностью действия наделены также белки, кото-

рые участвуют в таких процессах, как дифференцировка и деление клеток,

развитие живых организмов, определяя их биологическую индивидуальность.__