Метод полужидких сред (Пешкова)

Среда представляет собой высококачественный полужидкий мясопептонный агар, разлитый в пробирки в виде столбика. Посев иссле­дуемых бактерии производят уколом. Подвижные микроорганизмы на этой среде дают диффузный рост, неподвижные - рост по ходу укола. Рост подвижных и неподвижных микробов зарисовать.

Контрольные вопросы

Из каких трех основных систем состоит электронный микроскоп просвечивающего типа?

Почему разрешающая способность электронного микроскопа во много раз выше разрешающей способности светооптических микроскопов?

Какова длина волны электронов?

Для чего необходим высокий вакуум в колонне электронного микроскопа?

Какие линзы имеются в электронном микроскопе и какую роль они выполняют?

За счет чего создается видимое изображение объекта в электронном микроскопе?

Из чего складывается общее увеличение электронного микроскопа? . Каково назначение пленок-подложек и из какого материала они готовятся?

Каково назначение опорных сеток и из чего они готовятся?

Для чего применяют контрастирование объектов, изучаемых в электронном микроскопе?

В чем заключается принцип негативного и позитивного контрастирования?

В чем заключается сущность метода оттенения?

С какой целью и с помощью каких реактивов осуществляется фиксация препаратов для электронной микроскопии?

С какой целью производится обезвоживание объектов для электронной микроскопии?

Какие виды ножей используются для получения ультра тонких срезов?

Какие принципы положены в основу работы ультрамикротомов?

В чем преимущество использования ультратонких срезов для изучения структуры бактерий и вирусов?

В чем заключается сущность метода микроскопии в темном поле?

Что такое фазовоконтрастная микроскопия и в чем ее преимущества?

Какие формы имеют бактерии?

На какие группы делятся кокки и палочковидные формы по харак­теру взаиморасположения клеток?

В каких случаях употребляют термины "бактерии" и "бациллы"?

Как классифицируются бактерии в зависимости от количества и расположения жгутиков?

Что такое колония, культура и штамм бактерий?

На чем основан принцип окраски жгутиков, позволяющий наблюдать их в оптическом микроскопе?

Какие методы используются для определения подвижности бактерий?

Как готовится препарат "висячая капля"?

Как должно быть установлено освещение микроскопа при рассмотрении "висячей капли"?

Как избежать повреждения препарата при микроскопии "висячей капли" ("раздавленной капли")?

В чем заключается принцип фазовоконтрастной микроскопии?

Как растут подвижные и неподвижные бактерии при посеве уколом на полужидкую среду Пешкова?

З А Н Я Т И Е 3

Дата____________________

Тема: МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. СТРОЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.

План занятия

1.Знакомство с основными анилиновыми красителями и приготов­лением их растворов для окрашивания микроорганизмов.

2.Приготовление препарата-мазка, фиксирование его, окрашивание и микроскопия.

3.Сложные методы окраски микробов. Окраска по Граму с применением контролей и без них.

4.Включения у бактерий. Окраска зерен волютина по Нейссеру.

5.Капсула у бактерий. Окраска капсул в препаратах-мазках из культуры палочки Фридлендера по методу Бурри-Гинса.

6.Споры у бактерий. Исследование спор в неокрашенных препа­ратах (раздавленная капля) и в препаратах-мазках, окрашенных вод­ным фуксином и по Клейну.

7.Изучение клеточных ультраструктур по электронограммам.

Методические указания

§ 2. На чистое предметное стекло нанести каплю воды. Прокаленной ж остуженной петлёй захватить очень небольшое количество микробной массы и коснуться ею капли так, чтобы оставить в ней облач­ко помутнения. Прокалить и остудить петлю и, перемешав каплю, раз­мазать ее тонким слоем по стеклу, после чего петлю снова прокалить и поставить в штатив.

Подсушить приготовленный мазок на воздухе. Зафиксировать ма­зок путем проведения нижней стороной через пламя 3-4 раза. Фиксирование считается хорошим, если стекло, приложенное к тыльной поверхности кисти, дает ощущение легкого жжения. При отсутствии та­кого ощущения препарат может смыться, а при ощущении ожога микроскопическая картина будет искажена.

Положить препарат на мостик для окраски мазком вверх и налить на неге раствор краски - фуксин Пфейффера или метиленовый синий. Окраска фуксином производится в течение 1-2 минут, метиленовым синим - в течение 3-5 минут,

Слить краску и тщательно промыть препарат водой. Обсушить препарат фильтровальной бумагой. Микроскопировать с иммерсионным объективом. Микроскопическую картину зарисовать в тетрадь.

§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.

На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной карболовый раствором генцианвиолета и увлажняют его 2-3 каплями воды. Окрашивание продолжается 2 минуты.

Рис.1 Окраска по Граму Кишечная палочка

Рис.2 Окраска по Граму Стафилококк

Рис.3 Окраска по Граму Исследуемая культура

Сбросив пинцетом фильтровальную бумагу, на препарат наливают на 2 минуты раствор Люголя. Слив раствор Люголя, не промывая препарат, наливают на него для обесцвечивания несколько капель 96⁰ спирта на 30 секунд (обес­цвечивание должно производиться при покачивании стекла).

Быстро смыв спирт водой, препарат докрашивают раствором фук­сина Пфейффера в течение 1-2 минут, после чего промывают водой и высушивают.

Для окраски по Граму на одном стекле готовятся три мазка из разных культур (для контроля). Мазок в середине стекла готовят из изучаемой культуры, а по концам стекла с одной стороны - из куль­туры стафилококка (заведомо грамположительная); а с другой - из культуры кишечной палочки (заведомо отрицательная).

Приготовленный таким образом тройной препарат-мазок подсуши­вают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают как один мазок, чтобы соблюсти одинаковые условия. Лишь при правиль­ной окраске контролей (темно-фиолетовый стафилококк и розовая кишечная палочка) можно считать правильной и окраску среднего мазка, то есть изучаемой культуры.

Из исследуемой культуры приготовить два препарата и окрасить по Граму, один с контролями, а другой без них, промикроскопировать и зарисовать их.

§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.

Фиксированный мазок окрашивают заранее приготовленной уксуснокислой синькой Нейссера 5 минут. Промывают препарат водой и обра­батывают его раствором Люголя в течение I минуты. Не промывая водой, докрашивают препарат везувином 15 секунд. Затем промывают, высу­шивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а тело бактерий - в соломенно-желтый цвет.

§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.

На предметное стекло нанести каплю туши, внести в нее неболь­шое количество исследуемой культуры с помощью бактериальной петли, тщательно перемешать. Ребром второго предметного стекла сделать мазок, как для исследования крови. Высушить мазок на воздухе и зафиксировать на пламени спиртовки. Нанести на мазок несколько капель водного фуксина на 2-3 минуты, затем промыть, высушить и промикроскопировать. На фоне туши четко видны окрашенные фуксином бактериальные клетки, окруженные светлым овалом (капсулы). Зарисовать препарат.

§ 6. В препарате "раздавленная капля" споры, обладающие более высоким коэффициентом преломления, выглядят в виде блестящих или темных (в зависимости от Фокусировки объектива) образований, отличающихся от более тусклых и неясно очерченных тел бактерий.

При окраске фуксином Пфейффера споры не окрашены и выглядят в виде бесцветных овальных образований, расположенных внутри окрашенных клеток или свободно лежащих между клетками.

Для окраски препарата по способу Клейна фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, на бумагу налива­ют карболовый фуксин Циля и подогревают препарат над спиртовкой до появления паров 4-5 раз. Пинцетом снимают бумажку и обесцвечивают препарат, погружая его в стаканчик с 1% -ным раствором серной кислоты на 5-6 секунд. Тщательно промывают препарат и дополни­тельно докрашивают метиленовым синим 3-5 минут. Промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют. Споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки - в синий. Всё приготовленные препараты зарисовать.

§ 7. Демонстрация электронограмм ультратонких срезов различных видов бактерии. Определить на электронограммах клеточную стен­ку, цитоплазматическую мембрану, мезосомы, рибосомы и нуклеоид (ядерную вакуоль).

Рис.4 Зерна волютина;окраска по Нейссеру

Рис.5 Капсулы у бактерий; окраска по методу Бури-Гинса. Klebsiella pneumoniae

Рис.6 Споры бактерий; окраска фуксином

Рис.7 Споры бактерий; окраска по Клейну

Рис.8 Споры бактерий; “раздавленная капля”

Контрольный вопросы.

Какие красители - кислые или основные - чаще применяются при окрашивании бактерий и почему?

Какие основные красители красного, синего, фиолетового и ко­ричневого цвета применяются в микробиологии?

Как готовится концентрированный карболовый раствор основного фуксина и насыщенный раствор метиленового синего?

Какие способы окрашивания микробов Вы знаете?

Из каких последовательных этапов складывается приготовление препарата-мазка?

Для чего необходима фиксация препарата-мазка?

Какие способы фиксации препаратов Вы знаете?

Как производится фиксация на пламени и как контролируется ее качество?

Как определить, на какой стороне стекла находится мазок?

В чем заключается принцип окраски по Граму?

В какой цвет окрашены грамположительные бактерии и почему?

Какова методика окраски по Граму?

Как контролируется правильность окраски по Граму?

Почему зерна волютина окрашенные метиленовым синим, получили название метахроматических?

Какие образования составляют оболочку бактерий?

Что представляют собой цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка и капсула?

Какие включения могут быть в цитоплазме бактерий?

Какую роль играют капсулы у патогенных бактерий?

По каким признакам можно заподозрить наличие капсул в микроб­ной культуре?

Что такое споры бактерий, каковы их свойства?

Как можно заподозрить наличие опор в микробной культуре?

Каковы принципы окраски капсул у бактерии?

Каковы принципы окрашивания спор у бактерий?

С чем связана высокая терморезистентность спор?

Какова структура пептидогликана?

Каковы функции клеточной стенки бактерий?

Каковы функции цитоплазматической мембраны?

Что такое рибосомы?

Чем отличается ядерный аппарат бактерий от ядерного аппарата эукариотов?