Тема 22.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ОНКОГЕННЫМИ ВИРУСАМИ ЧЕЛОВЕКА И ВИРУСАМИ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

План

Программа

Биологические свойства онкогенных вирусов. Вирус­ные и клеточные онкогены и антионкогены. Роль онкогенных вирусов в патогенезе злокачественных но­ вообразований человека.

Биологические свойства ВИЧ. Экология ВИЧ и эпи­демиология ВИЧ-инфекции, группы риска. Патоге­нез, диагностика, принципы профилактики и лечения ВИЧ/СПИД. СПИД-ассоциированные оппортунисти­ ческие инфекции.

а Задание студентам

Ознакомиться с бланками направлений на исследова­ние в вирусологическую лабораторию.

Указать материал для диагностики ВИЧ-инфекции.

Ознакомиться с тест-системами для серодиагностики ВИЧ-инфекции.

Оценить результаты серодиагностики ВИЧ-инфекции методом ИФА и наметить план дальнейшего обследо­вания.

а Методические указания

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных HPV

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазок-соскоб или биоптат из пораженного участка кожи или слизистой оболочки.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Цитологический метод — обнаружение измененных клеток с признаками ЦПД (коилоциты).

Вирусоскопический метод — обнаружение зрелых вирусных частиц в зараженных клетках. Этот метод позволяет обнару­жить вирусы только в случае их репродукции. В опухолевых клетках присутствуют дефектные вирусы, не способные к реп­родукции.

Вирусологический метод — не применяют в связи со слож­ностью культивирования вируса.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические иссле­дования. Обнаружение вирусных антигенов в зараженных клетках методом ИФ.

Молекулярно-биологические исследования. Обна­ружение вирусных ДНК в зараженных клетках — метод ДНК-зондов (ДНК-гибридизация in situ), ПЦР. Эти методы позво­ляют диагностировать латентную инфекцию и присутствие де­фектных вирусов.

Серодиагностика. С целью диагностики ЯРК-инфекции вы­являют антитела к белкам капсида и вирусным онкогенам.

• Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных BKV

и /СУ (см. главу 21 и главу 19 соответственно)

• Диагностика инфекций, вызванных HTLV

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Серодиагностика — обнаружение антител к вирусным бел­кам — применяют для выявления вирусоносительства и лабо­раторной диагностики тропического спастического паралича (см. также главу 19).

• Микробиологическая диагностика ВИЧ-инфекции

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, лейкоциты пе­риферической крови, пунктах лимфатических узлов и костного мозга. Вирус также может быть обнаружен в отделяемом сли­зистых оболочек генитального тракта, сперме, слюне, слезной жидкости, грудном молоке, спинномозговой жидкости, в труп­ном материале.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Вирусологический метод (схема 22.1.1). Выделение вируса из крови и лейкоцитов в связи со сложностью культивирования в клинической практике используется редко. Основным пока­занием к применению является раннее обнаружение вируса у новорожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Вирус вы­деляют путем совместного культивирования мононуклеарных лейкоцитов периферической крови пациента с лейкоцитами здоровых доноров в присутствии IL-2 для стимуляции роста Т-лимфоцитов. ЦПД проявляется образованием синцития и лизисом зараженных клеток. Метод позволяет выявить латент­ную инфекцию. О присутствии вируса судят по результатам определения специфических антигенов ВИЧ (р24, обратной транскриптазы) в культуральной среде и зараженных клетках. Культивирование ВИЧ требует соблюдения специальных усло­вий безопасности при работе.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические иссле­дования. Обнаружение вирусных антигенов (р24) в крови и лимфоцитах с помощью ИФА. Следует учитывать, что р24 в достаточном для выявления количестве присутствует в крови только при первичной инфекции и на поздних стадиях забо­левания.

Молекулярно-биологические исследования. Об­наружение РНК вирусов в крови методом RT-ПЦР. Метод основан на преобразовании вирусной РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием фермента обратной транс­криптазы (RT) и амплификации полученной кДНК методом ПЦР — применяется для определения уровня вирусемии. Чув­ствительность метода позволяет обнаруживать вирус в малых концентрациях.

Серодиагностика. Обнаружение антител к вирусным антиге­нам (поверхностным белкам gp!20) — методы ИФА — приме­няют для массового обследования. В случае положительного результата с целью верификации осуществляют поиск антител к индивидуальным вирусным белкам методом иммуноблоттин-га, непрямой ИФ и другими методами.

Метод иммуноблоттинга ("вестерн-блот") — тестирование сыворотки на наличие антител против отдельных вирусных антигенов сердцевины и поверхностной оболочки ВИЧ. Вирус­ные белки с помощью электрофореза в вертикальном блоке полиакриламидного геля разделяют по молекулярной массе и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, где антитела сы­воротки реагируют с индивидуальными вирусными белками. Образующиеся иммунные комплексы выявляются авторадио-графически или с помощью ИФА.

Для косвенного подтверждения диагноза СПИД могут быть использованы методы оценки иммунного статуса: определение общего количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, соотношения CD4⁺/CD8⁺ Т-лимфоцитов, количества натуральных килле­ров, уровней сывороточных иммуноглобулинов. Для СПИД характерно развитие Т-клеточного дефицита: снижение коли­чества Т-лимфоцитов, преимущественно Т-хелперов CD4+ (менее 500/мм³), снижение уровня показателя CD4⁺/CD8⁺ ниже 1,0; уменьшение количества натуральных киллеров; уме­ренная поликлональная гипергаммаглобулинемия с увеличени­ем содержания IgG.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Тест-системы для диагностики ВИЧ/СПИД методом ПЦР.

Тест-системы для серодиагностики ВИЧ/СПИД методом ИФА.

Тест-системы для диагностики папилломавирусной инфек­ции методом ПЦР.

Противовирусные препараты:

Ингибиторы обратной транскриптазы: азидотимидин (AZT), ди-дезоксиинозин (DDI), дидезоксицитидин (DDC), невирапин и др.

Ингибиторы протеазы: саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир и др.

Препараты для иммунотерапии: интерферон человеческий лейкоцитарный; интерферон рекомбинантный.

Глава 23

ВОЗБУДИТЕЛИ МИКОЗОВ

Заболевания, вызываемые грибами (myces), — микозы, чрезвычайно разнообразны как по биологическим особеннос­тям их возбудителей, так и по патогенезу и клиническим про­явлениям (табл. 23.1). Важную роль в развитии микозов играют иммунодефицитные состояния, изменения экологических фак­торов. Некоторые грибы рассматриваются как возбудители вто­ричных инфекций, например при ВИЧ/СПИД, а также имеют значение при развитии дисбактериоза.

Лабораторная диагностика микозов проводится в микологи­ческих лабораториях или в специализированных микологичес­ких центрах.

Микроорганизмы Заболевания (локализация поражений) Возбудители глубоких (системных) микозов Histoptasma capsulatum Гистоплазмоз Coccidioides immitis Кокцидиомикоз Blastomyces dermatitidis Бластомикоз (северо-американский) Cryptococcus neoformans и др. Криптококкоз Возбудители эпидермомикозов (дерматомикозов) Trichophyton spp. Микоз гладкой кожи, стоп, паховой области, волосистой части головы, ногтевых пластинок Epidertnophyton spp. Микоз паховой области, стоп, ногте­вых пластинок Microsporum spp. Микоз волосистой части головы и гладкой кожи Условно-патогенные грибы и вызываемые ими микозы Candida spp. Кандидоз кожи и слизистых оболочек полости рта, мочеполовой системы, дыхательной системы, кишечника и др. Aspergillus spp. Аспергиллез дыхательной системы, ушей и др. Pneumocystis carinii и др. Пневмоцистоз дыхательной системы (пневмония, развивающаяся на фоне иммунодефицита)

Определение видовой принадлежности грибов рода Candida.

РСК и реакция агглютинации при диагностике висце­рального кандидоза с парными сыворотками.

Морфология и культуральные свойства плесневых и других грибов (рост на плотных питательных средах).

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

а Задание студентам

Указать материал для исследования.

Микроскопировать и зарисовать препараты дрожжеподобных грибов рода Candida, приготовленные из чистой культуры и патологического материала.

Определить видовую принадлежность грибов рода Candida на основании морфологии клеток и колоний, типа филаментации и биохимических свойств.

Оценить результаты РСК для серодиагностики висце­рального кандидоза. Сделать заключение.

Дать краткую характеристику демонстрируемым диа­гностическим, профилактическим и лечебным пре­паратам.

а Методические указания

• Микробиологическая диагностика кандидоза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: налет со слизистых оболочек, кожные чешуйки из очага поражения, мокрота, мо­ча, спинномозговая жидкость, кровь и др.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Микроскопическое исследование. При исследовании пре­паратов используют окраску простыми методами, а также по методам Романовского—Гимзы, Грама и др. Грибы рода Can­dida хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. При необходимости исследуют нативные препараты. В нативных и окрашенных препаратах видны одноклеточные микроорганиз­мы круглой или овальной формы.

Микологическое (культуральное) исследование. Делают посев исследуемого материала на агар Сабуро или другие специаль­ные среды. Посевы инкубируют при 20 и 37 "С. Рост колоний начинается на 2—3-й сутки, и окончательное формирование происходит через 5—6 дней. Идентификацию грибов рода Can­dida проводят на основании морфологии клеток, типа фила­ментации и биохимических свойств (табл. 23.1.1). Важное диа­гностическое значение имеют многократные количественные посевы исследуемого материала. Нарастающее количество ко­лоний в посевах подтверждает диагноз.

Вид Морфо- Культуральные Биохимические свойства — логия свойства ферментация Сахаров колонии преобла- глю- саха- маль- лак-дающий козы розы тозы тозы тип фи-ламента-ции C.albicans Крупные, Круглые, Мусо- КГ — КГ — круглые, смегано- toruloi-овальные образные, des края ров­ные C.tropicalis Оваль- Круглые, Мусо- » КГ » — ные, смегано- toruloi-удлинен- образные, des ные края ров­ные или зубчагые C.krusei Удлинен- Круглые, Мусо- » — — — ные суховагые, toruloi-неровные des края

Trichophyton (Achorion) schoenleinii (фавус или парша) — в во­лосе обнаруживают полиморфные грибковые элементы. Наря­ду с тонким мицелием встречается мицелий широкий, состо­ящий из прямоугольных клеток. Часто наблюдаются споры круглой или прямоугольной формы, а также пузырьки воз­духа.

Epidermophyton floccosum (эпидермофития паховая) — эле­менты гриба содержатся в чешуйках кожи, где располагаются в виде толстых септированных ветвящихся нитей мицелия на­ряду со спорами многогранной формы.

Микологическое (культуральное) исследование. Проводят для установления родовой и видовой принадлежности возбудителя путем выделения чистой культуры гриба и изучения его био­логических свойств. Материал предварительно обрабатывают кислотами или антибиотиками. Затем делают посев на сахар­ный питательный агар, сусло-агар, агар Сабуро, овощные сре­ды (см. тему 4.1), куда добавляют антибиотики для задержки роста бактериальной флоры. Посевы инкубируют при 30 "С. В положительных случаях рост наблюдается на 3—5-е сутки в виде разнообразных колоний: гладких, морщинистых, мучнис­тых, пушистых, часто пигментированных. При микроскопии препаратов, приготовленных из культур, хорошо заметен раз­витой, широко ветвящийся септированный мицелий. Органа­ми размножения служат споры, которые могут быть как внут­ренними (эндоспоры), расположенными внутри мицелия, так и наружными (экзоспоры), расположенными на концах или по сторонам нитей мицелия. Специальных органов плодоношения типа асков (сумок) у дерматофитов не обнаружено, что дало основание отнести их к несовершенным грибам — Fungi imper-fecti.

• Микробиологическая диагностика глубоких (системных) микозов

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, моча, пора­женные ткани, биоптаты кожи и лимфатических узлов, спин­номозговая жидкость и др.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Микроскопическое исследование. Обнаружение овальных дрожжевых или других тканевых форм грибов позволяет по­ставить предварительный диагноз. Иммунофлюоресцентный метод является наиболее эффективным способом выявления возбудителя в патологическом материале (см. ниже).

Микологическое исследование. Производят посев материала на среду Сабуро, кровяной агар и другие среды. Посевы инку­бируют в течение нескольких недель при 37 и 20 "С. Выделенные культуры идентифицируют на основании морфологических и

биохимических признаков. Грибы, вызывающие глубокие ми­козы, относятся к группе возбудителей ООИ, представляющих биологическую опасность IV степени (см. главу 11). Необхо­димо помнить, что лабораторная диагностика этих инфекций осуществляется только в специализированных лабораториях.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. При криптококкозе определяют антиген в спинномозговой жидкости и в сыворотке крови (у больных ВИЧ/СПИД) в динамике заболевания.

Молекулярно-биологические исследования. Ис­следуемый материал, полученный из очага инфекции, исполь­зуют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поста­вить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Проводят для определения антител, кото­рые обнаруживаются в сыворотке крови через 2—4 нед после начала заболевания. Обычно используют РСК, РНГА, реакции иммунодиффузии, ИЭФ и др.

Кожно-аллергические пробы. Применяют для выявления со­стояния ГЗТ к соответствующим аллергенам.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Кандидозный антиген — взвесь 2-суточной агаровой культу­ры грибов рода Candida в изотоническом растворе хлорида натрия. Применяют для постановки реакции агглютинации для серодиагностики кандидоза.

Кандидозный антиген для РСК — спиртово-водный экстракт из культуры гриба рода Candida. Применяют для постановки РСК и кожно-аллергических проб при кандидозе.

Противогрибковые препараты: полиеновые антибиотики (нистатин, леворин, амфотерицин В), кетоконазол, флуконазол и другие производные имидазола, полиоксины, эхинокандины, 5-фторцитозин, гризеофульвин.

Глава 24