Тема 12.2. АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ - ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

План

Программа

Биологические свойства возбудителей анаэробных гнойно-воспалительных и раневых инфекций, их патогенность, экология, особенности инфекций и эпи­демиология вызываемых заболеваний.

Микробиологическая диагностика гнойных заболева­ний, вызванных неспорообразующими анаэробами.

Микробиологическая диагностика газовой гангрены.

Микробиологическая диагностика столбняка.

Биохимические и молекулярно-биологические методы диагностики анаэробной инфекции.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

Демонстрация

1. Мазки из чистых культур Clostridium petfringens, С. teta-ni, Bacteroides fragilis. Мазки из раневого отделяемого, содержащие смешанную микрофлору (клостридии, ста­филококки, грамотрицательные бактерии и др.).

Методика посева для выделения патогенных анаэробов.

Аппаратура и питательные среды для выращивания анаэробов.

Определение сс-токсина клостридий в раневом отделя­емом с помощью летициназной пробы.

а Задания для выполнения лабораторной работы

Бактериоскопическое исследование: приготовить мазки из гноя, окрасить их по методу Грама и микроскопировать. Сделать предварительное заключение и на­метить ход дальнейшего исследования.

Сделать окончательное заключение о возбудителе или возбудителях раневой инфекции на основании бактериоскопических, бактериологических и других дан­ных, полученных из бактериологической лаборатории.

Методические указания

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной, раневое отде­ляемое, кусочки мышечной ткани, перевязочный материал и др., кровь — при сепсисе. Для обеспечения бескислородных условий взятие материала производят шприцем с хорошо при­тертым поршнем до полного его заполнения и вытеснения воздуха. Затем шприц надевают на иглу, вставленную через резиновую пробку в пробирку со смесью инертных газов (N2 + Н2) и СО₂, и вводят в нее исследуемый материал, кото­рый изучают в микробиологической лаборатории. Используют также различные специальные транспортные среды, в которые помещают материал, взятый у больных.

• Микробиологическая диагностика гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных неспорообразующими анаэробными бактериями

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гной из очага, кровь — при сепсисе.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (см. схему 12.1.1). Из ис­следуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Наличие в препаратах бактерий позволяет поставить ориентировочный диагноз и наметить план дальней­шего исследования.

Бактериологическое исследование. Посевы производят на элек­тивные обогатительные среды для анаэробов (среда Китта—Та-роцци, тиогликолевый бульон или полужидкий тиогликолевый агар), содержащие специальные добавки (гемин, витамин К и др.), и инкубируют при 37 °С в течение 24—48 ч. После про­смотра выросшей культуры делают мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. Бактериоскопия дает воз­можность установить однородность или неоднородность куль-

Признак Бактерии Pep- Pep- Veil- Вас- C.per- C.no- C.se- C.so- C.hi-to- tost- lonel- teroi- frin- vy pti- rdel- stoly-coc- repto- la des gens cum li ticum cus coc­cus Форма и распо- i § ложение бакте- § я g риальных клеток я s sS « и н И я « « а •"* * » п s 2 "^ 2 *" 2 U2 аЙ нЙ §й ой ой 2^ Ээ* S&" sf §у §* * S ? п §2 So Ео Ро а о ео ео S2 к Я S*? 34 ffe; рч ^ч оЧ 5ч Во >£-о .9 о «и и .R<e3 .R^d ,0с9 м сЗ «и и Ox EJ и fc^c Sc fc^c ЪА с Не 2е 2с Подвижность _ — _ + __ + + + + Споры ____ + + + + + Окраска по ме- + + — — + + + + + тоду Грама Ферментация с + — + + с + с — углеводов Свертывание — — + + + х — + + или пептониза-ция молока Образование +_+ +___х х H2S Образование + — — +_____ индола Разжижение же- — — — + + + + + + латина Восстановление + — + ±ххх — — нитратов Гемолиз эритро- + — — ±х + + + + цитов Образование ____ + + + + + токсина

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследова­ния. Анаэробные бактерии вырабатывают специфические ме­таболиты, включая летучие жирные кислоты с короткой цепью, спирты и нелетучие органические кислоты. Для их обнаруже­ния в материале от больного используют ГЖХ (см. главу 11).

• Микробиологическая диагностика раневой анаэробной кло-стридиальной инфекции — газовая гангрена (схема 12.2.1).

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: раневое отделяемое, отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, перевязочный материал, кетгут. Рекомендуется брать материал из разных участ­ков очага поражения, особенно из глубоких слоев. Кровь — при сепсисе.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Проводят путем микро­скопии мазков, приготовленных из отечной жидкости или некротизированной ткани. Наличие в препаратах крупных (1—1,5x3—10 мкм) грамположительных палочек, некоторые из которых (C.perfringens) образуют макрокапсулу (рис. 12.2.1; на вклейке), позволяет поставить предварительный диагноз.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал вно­сят в несколько пробирок со средой Китта—Тароцци, железо -сульфитным агаром (среда Вильсона—Блера) и молоком. Часть пробирок прогревают при 80 "С в течение 30 мин для уничто­жения неспорообразующих бактерий. Посевы инкубируют в обычном термостате при 37 'С. C.perfringens растет в глубине среды. В молоке уже через 3—4 ч посева образуется губкооб-разный сгусток, содержащий пузырьки газа и отделившуюся прозрачную жидкость. Через сутки на среде Китта—Тароцци отмечается помутнение и газообразование, а на железосуль-фитном агаре несколько позднее появляются черные колонии в глубине агарового столбика. Для получения культур других видов клостридий требуются более строгие анаэробные усло­вия. Из всех посевов делают мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При положительном результате обнаруживаются крупные грамположительные палочки.

Для получения чистой культуры делают пересевы на сахар­ный кровяной агар в чашки Петри и инкубируют в строго анаэробных условиях при 37 °С в течение 3—4 дней. Выросшие колонии пересевают в пробирки со средой Китта—Тароцци. Идентификацию чистой культуры производят на основании признаков, перечисленных в табл. 12.2.1. Идентификация по биохимическим признакам осуществляется традиционными методами или с помощью тест-систем для определения специ­фических бактериальных ферментов или метаболитов.

Реагент Количество реагента, мл пробирка пробирка пробирка пробирка 1234 Исследуемый материал 0,3 0,3 0,3 0,3 Лецитин 0,1 0,1 0,1 -Раствор хлорида натрия 0,1 — 0,2 Сыворотка ати-C.perfringens — 0,1 — — Сыворотка анти-C.novy — — 0,1 — Инкубация при 37 "С в течение 46—60 мин Учет результатов (наличие помутнения)

• Микробиологическая диагностика столбняка (см. схему 12.2.1)

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кусочки ткани вокруг предполагаемых входных ворот инфекции, перевязочный ма­териал, кетгут. Рекомендуется брать материал из разных участ­ков очага поражения, особенно из глубоких слоев. При подо­зрении на столбняк у женщин после родов или аборта — вы­деления из матки, у новорожденных — выделения из пупочной раны.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Материал засевают в среду Китта—Тароцци и инкубируют в анаэробных условиях при 37 "С в течение 3—4 сут, наблюдая придонный рост бактерий. Затем делают посевы на сахарный агар в чашки Петри, в столбик сахарного питательного агара в пробирке. Посевы также инкубируют в анаэробных условиях. На поверхности кровяного агара С.tetan/образует нежные прозрачные колонии, окруженные малозаметной зоной гемолиза. Для получения чистой культуры подозрительные колонии пересевают в про­бирки со средой Китта—Тароцци и сохраняют их под слоем вазелинового масла или в эксикаторе, заполненном смесью инертных газов. Для определения способности выделенной чистой культуры к образованию столбнячного токсина (токси-генности) используют серологические реакции (преципитации в геле и др.) с антителами к тетаноспазмину. Бактериологичес­кий метод используют в качестве дополнительного метода для подтверждения диагноза, поскольку он не дает своевременного результата.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Токсин в материале может быть обнаружен с помощью серологических реакций in vitro (ИФА и др.). Метод позволяет получить ответ в течение нескольких часов и обеспечивает своевременную диагности­ку заболевания.

Биопроба. Проводят для обнаружения столбнячного токсина в исследуемом материале. С этой целью материал растирают в стерильной ступке с песком, заливают изотоническим раство­ром хлорида натрия для экстрагирования токсина и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вводят внутримышечно бе­лым мышам. Животным контрольной группы вводят смесь фильтрата с антитоксической сывороткой. Через 1—2 сут у мышей появляется ригидность мышц хвоста и задних конеч­ностей. В результате резкого сокращения хвостовых мышц хвост поднимается в виде дуги. Затем подопытные животные погибают. У животных в контрольной группе признаки инток-

сикации отсутствуют вследствие нейтрализации токсина анти­сывороткой. В настоящее время биопроба практически не при­меняется.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Антитоксические противогангренозные сыворотки — монова­лентные (антиперфрингенс, антиэдематиенс — антинови, анти-септикум и др.) и поливалентная. Сыворотки получают путем иммунизации лошадей соответствующими анатоксинами, с по­следующей очисткой и концентрацией методом ферментатив­ного гидролиза (диаферм-3). Препараты выпускаются в жид­ком и сухом виде. Применяют для экстренной пассивной про­филактики и специфической иммунотерапии газовой гангрены.

Адсорбированный столбнячный анатоксин. Получен путем обезвреживания формалином столбнячного токсина с после­дующей его очисткой, концентрацией и адсорбцией на гидрате оксида алюминия. Входит в состав ассоциированной коклюш-но-дифтерийно-столбнячной вакцины и других препаратов. Применяют для активной иммунизации против столбняка.

Противостолбнячная сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных столбнячным анатоксином. Очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность измеряет­ся в международных единицах. Применяют для экстренной пассивной профилактики и лечения столбняка.

Иммуноглобулин человеческий противостолбнячный. Получен из гамма-глобулиновой фракции крови доноров, ревакциниро-ванных очищенным адсорбированным столбнячным анатокси­ном. Применяют для экстренной пассивной профилактики и лечения столбняка.

Антибиотики. Грамположительные бактерии — р-лактамные антибиотики, ванкомицин, тетрациклины, макро-лиды, линкомицины, метронидазол.

Грамотрицательные бактерии — р-лактамы, спектр действия которых сдвинут в сторону грамотрицательных мик­роорганизмов, хлорамфеникол, тетрациклины, сульфанилами­ды, метронидазол.

Аминогликозиды и фторхинолоны, как правило, не активны по отношению к анаэробным микробам.

Глава 13