Тема 8.1. МИКРОФЛОРА ВОДЫ, ВОЗДУХА И ПОЧВЫ. МЕТОДЫ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ, ВОЗДУХА И ПОЧВЫ

План

Программа

Микрофлора воды, воздуха и почвы.

Санитарно-показательные микроорганизмы и их зна­чение.

Методы определения коли-индекса, коли-титра и микробного числа воды.

Методы определения микробного числа воздуха.

Методы определения перфрингенс-титра, коли-титра и микробного числа почвы.

Демонстрация

Санитарно-бактериологическое исследование воды методом мембранных фильтров.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха.

Аппарат Кротова. Рост микроорганизмов на МПА в чашке Петри. Рост гемолитических стрептококков на кровяном агаре.

Санитарно-бактериологическое исследование почвы.

Рост Proteus vulgaris (по Шукевичу).

Задание студентам

Провести оценку санитарно-бактериологического со­ стояния воды по результатам определения микробного числа, коли-индекса и коли-титра.

Провести оценку санитарно-бактериологического со­ стояния воздуха по результатам определения микроб­ного числа.

Провести оценку санитарно-бактериологического состояния почвы по результатам определения микробного числа, коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофильных бактерий.

Объект Характер загрязнения Санитарно-показательные бактерии Вода Фекальное Бактерии группы кишечных па­лочек Escherichia coli, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterococ-cus faecalis Почва То же Те же бактерии и клостридии ( Clostridium perfringens, С/, sporo-genes и др.) Промышленно-быто- Термофильные бактерии, Proteus вые (разлагающиеся vulgaris отбросы) Пищевые Фекальное Бактерии группы кишечных па-продукты лочек S. faecalis, P. vulgaris Орально-капельное Staphylococcus aureus Предметы Фекальное Бактерии группы кишечных па-обихода лочек, P. vulgaris, E. faecalis Орально-капельное S. aureus Воздух То же S. aureus, S. pyogenes Вода, Промышленное Производственные штаммы мик-почва, робов воздух

О микробной обсемененности судят по микробному числу — общему количеству микробов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 мл воды, 1 г почвы, 1 м³ воздуха). Содержание санитарно-показательных бактерий оце­нивают по двум показателям — титру и индексу. За титр при­нимают тот минимальный объем или массу исследуемого ма­териала, в которых обнаруживают санитарно-показательные бактерии; индекс показывает количество санитарно-показа­тельных бактерий, содержащихся в 1 л жидкости, 1 г плотных веществ, 1 м³ воздуха. К санитарно-показательным бактериям относятся представители облигатной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, для которых средой оби­тания являются кишечник или респираторный тракт. Они об­ладают следующими свойствами: 1) постоянно выделяются в большом количестве из организма во внешнюю среду; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сохраняться в окру­жающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или респираторном тракте; 4) не способны интенсивно размножаться на каких-либо объектах вне организма хозяина и изменять свои свойст­ва. Перечисленные признаки присущи ряду бактерий, которые признаны санитарно-показательными для различных объектов окружающей среды (см. табл. 8.1.1).

Санитарно-показательными микробами, свидетельствующи­ми о фекальном загрязнении окружающей среды, являются бак­терии группы кишечной палочки (БГКП). Они принадлежат к разным родам семейства Enterobacteriaceae. Дифференциально-диагностические признаки БГКП представлены в табл. 8.1.2. Обнаружение E.coli в каких-либо объектах окружающей среды или пищевых продуктах считается наиболее достоверным по­казателем свежего фекального загрязнения. Наличие бактерий родов Citrobacter и Enterobacter указывает на относительно дав­нее фекальное загрязнение. Присутствие Clostridium perfrin-gens, С. sporogens и других клостридий в почве свидетельствует о ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно сохраняться в окружающей среде (в частности, в почве). Обнаружение в объектах окружающей среды Enterococ-cusfaecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении. К группе термофильных бактерий относятся неродственные бактерии, представители различных семейств, способных раз­множаться при температуре 60 °С и выше (Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus и др.). Они не являются постоянными обитателями кишечника человека и не служат критериями фекального загрязнения окружающей среды. Резкое увеличе­ние количества этих бактерий может свидетельствовать о за­грязнении почвы разлагающимися отбросами, поскольку они размножаются в саморазогревающемся навозе и компостах.

Вид бактерий Признак продук- метило- реак- индоло- рост на рост в ты сбра- вый ция Фо- образо- цитрат- присут-живания красный геса— вание ной ствии Проска- среде KCN уэра Escherichia Смесь + — + — — coli кислот Citrobacter То же + — р + + freundii Enterobacter Бутан- — + — + + aerogenes диол

тельно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 1—2 сут. Воду из открытых водоемов засевают па­раллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37 °С в течение 1 сут, а другую — 2 сут при 20 "С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глу­бине среды колоний и вычисляют микробное число воды — количество микроорганизмов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды. Коли-mump воды — минимальное количество воды (мл), в котором обна­руживаются БГКП. Коли-индекс — количество БГКП в 1 л во­ды. Эти показатели определяют титрационным (бродильным) методом или методом мембранных фильтров.

Метод титрования. Производят посев различных объ­емов воды в глюкозопептонную среду (1 % пептонная вода, 0,5 % раствор глюкозы, 0,5 % раствор хлорида натрия, инди­катор Андреде и поплавок), причем для посевов больших ко­личеств (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ.

Воду открытых поверхностных водоемов исследуют в объ­емах 100; 10; 1,0 и 0,1 мл. Для исследования водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют в течение 1 сут при 37 "С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб произво­дят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по методу Грама и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia., Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семей­ства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бак­терий, обитающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают 2—3 изолированные колонии с поверхности среды, наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную ди-метил-п-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Грамотрицатель-ные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питательный агар с 0,5 % раствором глюкозы и инкубируют при 37 "С в течение 1 сут. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по статистической табл. 8.1.3.

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Мем­бранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100, 10, 1,0 и 0,1 мл, более загрязненную перед фильтрованием разводят стерильной

Количество положительных Коли Пределы индекса Коли -титр результатов индекс из 3 объ- из 3 объ- из 3 объ- нижний верхний емов по емов по емов по 100 мл 10 мл 1 мл 000 Менее 3 — — Более 3300 001 3 0,5 9 333 010 3 0,5 13 333 1 00 4 0,5 20 250 101 7 1 21 143 3 3 2 1100 150 4800 0,9 333 Более! 100 - — Менее 0,9

Показатель Норматив Число микробов в 1 мл воды, не более 100 Число бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды 3 (коли-индекс), не более

миксиновая и др.), инкубируют при 37 °С в течение 2 сут, через I 24 и 48 ч производят высевы на плотные элективно-дифферен­циальные среды: агар КФ, агар ТТХ (среда с трифенилтетра-золий-хлоридом), полимиксинтеллуритный агар. Идентифици­руют стрептококки по виду колоний, морфологии клеток и окраске по методу Грама. На среде с ТТХ стрептококки обра­зуют колонии темно-красного цвета, на агаре с теллуритом — черного цвета.

Состав сред. Среда КФ: 2 % питательного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 2 % лактозы, 0,4 % азида натрия, 0,06 % карбоната натрия, индикатор бромкрезоловый красный.

Полимиксиновая среда: 2 % питательного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 1 % глюкозы, полимиксин М 200 ЕД/мл, индикатор бромтимоловый синий.

Полимиксинтеллуритный агар: 2 % питательного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 1 % глюкозы, кристалличес­кий фиолетовый 1:800 000, полимиксин М 200 ЕД/мл, 0,01 % теллурита калия.

Агар трифенилтетразолий-хлорид (ТТХ): 2 % пита­тельного агара, 1 % дрожжевого экстракта, 1 % глюкозы, кристаллический фиолетовый 1:800 000, 0,01 % ТТХ.

При определении индекса E.faecalis пользуются статистичес­кими таблицами, применяемыми при установлении коли-ин-декса. Кроме того, с этой целью используют метод мембранных фильтров. Для обнаружения патогенных бактерий воду пропус­кают через мембранные фильтры, которые затем помещают в жидкие элективные среды или на поверхность плотных диф­ференциально-диагностических сред.

• Санитарно-бактериологическое исследование воздуха

Определение микробного числа воздуха. Количественные ми­кробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильт­рации.

Седиментационный метод. Две чашки Петри с пита­тельным агаром оставляют открытыми в течение 60 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37 "С. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чис­тым; 250—500 колоний свидетельствует о загрязнении средней степени, при количестве колоний более 500 — загрязненным.

Аспирационный метод. Это более точный количест­венный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляют с помощью приборов. Аппарат Кротова (рис. 8.1.1) устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром.

Место отбора проб Микробное число S.aureus (в 250 л) Операционные до начала работы Не более 500 Не допускается во время работы » » 1000 То же Родильные комнаты » » 1000 » » Палаты для недоношенных детей » » 750 » »
Характеристика почвы Коли-титр Перфрингенс- Количество титр термофильных бактерий в 1 г почвы Чистая 1,0 и выше 0,01 и выше 102— 103 Загрязненная 0,9—0,01 0,009—0,0001 От 1 03 до 1 05 Сильно загрязнен- 0,009 и ниже 0,00009 и ниже От 105 до 4хЮ6 нал

Задание студентам

Определить присутствие E.coli на коже рук и предме­тах обихода методом смывов; сделать заключение.

Провести санитарно-бактериологическую оценку мо­лока, лимонада, мяса и мясных консервов.

Перечислить продукты, подлежащие контролю на микотоксины, антибиотики, консерванты, пестициды.

Методические указания

Определение фекального загрязнения предметов обихода (ин­вентарь, оборудование, мебель, посуда, игрушки и др.) и рук персонала. Стерильным ватным тампоном, увлажненным изо­тоническим раствором хлорида натрия, делают смыв с иссле­дуемого предмета. Тампон помещают в среду Кесслера или втирают в поверхность среды Эндо. Посевы на плотных средах инкубируют при 37 "С, на жидких средах — при 43 °С.

Обсемененность предметов обихода золотистым стафило­кокком и фекальным стрептококком устанавливают аналогич­ным способом, используя для этого соответствующие питатель­ные среды (см. методы исследования воды и воздуха).

Санитарно-бактериологическое исследование молока и молоч­ных продуктов. О санитарно-бактериологическом состоянии молока и молочных продуктов судят по микробному числу и коли-титру. Для определения микробного числа пастеризован­ное молоко разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (1:10, 1:100, 1:1000) и по 1 мл каждого разве­дения выливают на дно стерильных чашек Петри, которые заливают расплавленным и остуженным агаром. Посевы инку­бируют при 37 °С в течение 1 сут, после чего подсчитывают количество выросших колоний. Для определения коли-титра цельное пастеризованное молоко засевают в 6 пробирок со средой Кесслера: в 3 пробирки вносят по 1 мл молока, а в остальные 3 — по 0,1 мл молока (1 мл молока разводят в 10 раз стерильной водой). Посевы инкубируют при 43 °С в тече­ние 1 сут, после чего из забродивших проб делают посевы на среду Эндо и инкубируют при 37 °С. Из выросших колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по методу Грама, микроскопируют и делают посев на среду Козера, а также в пептонную воду с 1 % глюкозы. Пробирки с посевами на среде Козера инкубируют при 37 "С, а на среде с глюкозой — при 43 °С в течение 1 сут. При оценке результатов учитывают бактерии, вызывающие брожение глюкозы с образованием кислоты и газа, но не дающие роста на цитратной среде Козера.

Аналогичным образом исследуют сливки, молочнокислые продукты, мороженое. Определяют величину коли-титра и про­водят оценку продукта в соответствии с нормативами (табл. 8.2.1; 8.2.2). Для обнаружения в молоке патогенных бактерий

Кишечная палочка обнаружена в следующих объемах, мл Коли-титр, мл 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 — — — — — — Более 3,0 4- 40 i -*— — - — • J )\J + + _____ Менее 3,0 + + + --- Более 0,3 + + + + - - 0,3 + + + + + - Менее 0,3 + + + + + + Более 0,03

Продукт Микробное Коли- Регламентирую-число — допус- титр щий документ тимое количест- не во микробов в менее 1 мл или 1 г, не более Молоко пастеризованное в бутылках и пакетах: группа А 5хЮ4 3,0 ГОСТ 13277-79 группа Б 105 0,3 Молоко во флягах и цис- 2x1 05 0,3 ГОСТ 13277-79 тернах Сливки пастеризованные: группа А 105 3,0 ОСТ 4964-74 группа Б 2хЮ5 0,3 Кисломолочные продукты Наличие толь- 0,3 ОСТ 4929-84 (кефир, простокваша, аци- ко микрофло-дофилин) ры закваски Молоко сгущенное с саха- 105 0,1 СТ 1390-78 ром Кофе со сгущенным моло- 3,5хЮ4 0,3 ГОСТ 719-54 ком и сахаром Какао со сгущенным моло- 3,5хЮ4 0,3 ГОСТ 718-54 ком и сахаром Мороженое 105 0,3 ОСТ 41 156-80 Детские молочные смеси 5x1 02 11,1 Инструкция пастеризованные и вареные ГС К 123-13, 132-1469

Состав сред. Среда Козера: дистиллированная вода, 0,15 % фосфата натрия-аммония, 0,1 % фосфата калия одно-замещенного, 0,02 % сульфата магния, 0,25 % цитрата калия.

Санитарно- бактериологическое исследование напитков (лимо­над, минеральные воды). При исследовании лимонада и мине­ральных вод определяют микробное число и коли-титр, ис­пользуя при этом методы, применяемые для исследования пи­тьевой воды. Перед проведением исследования лимонад нейтрализуют 10 % раствором гидрокарбоната натрия, прове­ряя реакцию среды с помощью лакмусового индикатора. Ото­бранные пробы минеральной воды выдерживают при 43 °С в течение 1 ч для удаления избытка газа. Коли-титр определяют методом мембранных фильтров. С этой целью 500 мл напитка фильтруют через мембранные фильтры (100 мл через 1 фильтр), после чего последние промывают стерильной водой для удале­ния остатков минеральных солей и помещают на поверхность среды Эндо. Посевы инкубируют при 37 "С. После определе­ния коли-индекса вычисляют коли-титр.

Санитарно-бактериологические нормативы для лимонада и минеральных вод соответствуют нормативам питьевой водо­проводной воды. Такие же требования предъявляют к воде, используемой для приготовления кваса и различных фрукто-во-ягодных безалкогольных напитков.

Санитарно-бактериологическое исследование мяса, колбасных изделий и мясных продуктов. При микроскопическом исследо­вании мяса определяют количество бактерий в мазках-отпечат­ках, которые готовят из кусочков мяса размером 2x1,5x2,5 см. Мазки окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Мясо считается свежим, если в поле зрения обнаружено не более 10 бактериальных клеток.

Бактериологическое исследование колбасных изделий и мясных продуктов проводят в соответствии с ГОСТом 9958-81: определяют микробное число, а также устанавливают присут­ствие БГКП, сальмонелл, бактерий рода Proteus, коагулазопо-ложительных стафилококков и клостридий. Анализ проводят не позднее чем через 4 ч с момента отбора проб, которые берут с поверхностных и глубинных участков продукта. При иссле­довании глубинных участков образцы продукта предварительно обрабатывают спиртом и обжигают. К навескам продукта мас­сой 20 г добавляют 80 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и гомогенизируют в электрическом смесителе. Для определения общего количества микробов в 1 г продукта делают посев 0,1 и 0,01 г продукта на питательный агар мето­дом пластинчатых разводок Коха, инкубируют 48 ч и подсчи­тывают число колоний. Для определения БГКП в 1 г продукта производят посев 5 мл взвеси на среду КОДА, которая является элективно-дифференциальной средой для БГКП и содержит питательный бульон, сульфанол, лактозу и бромтимоловый синий; инкубация продолжается 18—20 ч. При росте лактозо-положительных БГКП первоначальный синий цвет меняется на темно-зеленый или ярко-желтый. Специфические измене­ния на среде КОДА не требуют дальнейшего подтверждения. Определение сальмонелл проводят в навеске продукта не менее 25 г. Делают посев разведения навески в 100 мл среды обога­щения (Мюллера, Кауфмана), инкубируют 24 ч. При наличии Proteus spp. наблюдается ползучий рост. В мазках выявляют грамотрицательные палочки, определяют их подвижность и идентифицируют культуру бактерий. Для определения коагула-зоположительных стафилококков проводят посев 0,2 мл взвеси продукта на желточно-солевой агар, инкубируют посевы при 37 °С и при комнатной температуре. При обнаружении стафи­лококков проводят их идентификацию (см. тему 12.1). Для обнаружения анаэробных спорообразующих бактерий Clostri-dium perfringens делают посев 10-кратных разведений взвеси в сульфитциклосериновую среду (СЦС) и среду Вильсона—Бле-ра. Посевы инкубируют при 46 "С в течение 12 ч; при наличии С.perfringens наблюдается почернение среды. При положитель­ном результате посева разведения 10"¹ считается, что в 1 г продукта содержится 10 клеток соответствующих бактерий; разведения 10~² — 100 клеток и т.д.

Колбасные изделия и продукты из мяса в соответствии с действующими нормативами не должны содержать БГКП (в 1 г продукта), сальмонелл (в 25 г), бактерий рода Proteus и суль-фитредуцирующих клостридий (в 0,1 г); микробное число не должно превышать 10³.

Санитарно-бактериологическое исследование консервов. При исследовании консервов определяют присутствие аэробных и анаэробных бактерий. По эпидемиологическим показаниям выявляют Clostridium botulinum и проводят исследование на наличие ботулинического токсина. Перед бактериологическим исследованием консервную банку проверяют на герметичность в сосуде с горячей водой, ставят контроль на бомбаж, выдер­живая в термостате при 37 "С в течение 5 сут, после чего моют теплой водой, высушивают, протирают спиртом и обжигают верхнюю крышку смоченным спиртом горящим ватным там­поном. Извлеченное из банки содержимое засевают для выяв­ления аэробной флоры в две пробирки с бульоном, а для обнаружения анаэробной микрофлоры — в две пробирки со средой Китта—Тароцци, содержащей 0,15 % агара. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 сут. При появлении призна­ков роста аэробные бактерии пересевают на питательный агар, среду Эндо, скошенный агар (по Шукевичу) и на питательный агар с 1 % глюкозы. Из среды Китта—Тароцци берут 1—2 мл, вносят в чашки Петри и заливают расплавленным и охлажден­ным до 45—48 "С питательным агаром с 1 % глюкозы. После застывания на поверхность среды помещают стерильное предметное стекло (для создания анаэробных условий) и посевы инкубируют в течение 1 сут при 37 °С. Из выросших колоний получают чистую культуру, которую затем идентифицируют по обычной схеме.

Для выявления ботулинического токсина исследуемые про­бы консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию ней­трализации токсина антитоксическими противоботулиничес-кими сыворотками типов А, В, С, Е, F на белых мышах или обнаруживают присутствие токсина с помощью других сероло­гических реакций (иммуноферментный анализ). В консервах не допускается присутствия C.botulinum и его токсина, С.рег-fringens и других патогенных бактерий.

Присутствие аэробной неспорообразующей флоры указыва­ет на недостаточную эффективность примененных методов консервирования и возможность порчи. Присутствие сапро­фитных аэробных бацилл (B.subtilis, B.mesentericus) является до­пустимым при герметичности и отсутствии бомбажа консерв­ных банок.

Кроме санитарно-бактериологических исследований, осу­ществляют контроль продуктов на присутствие других токсич­ных соединений: микотоксинов — зерновые культуры, кофе-бобы, сыры, овощи, фрукты; антибиотиков — мясо, птица, яй­ца, молоко; консервантов — молочные, мясные, овощные про­дукты, напитки; пестицидов — зерновые культуры, овощи, фрукты.