Тема 7.2. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Введение. Антимикробные препараты (природные и синте­тические антибиотики) используются для лечения заболеваний, вызванных микроорганизмами. Для эффективной терапии необ­ходим подбор препарата, обладающего наибольшей активностью по отношению к данному возбудителю инфекции и оказываю­щего наименьший вред нормальной микрофлоре человека. Ши­рокое распространение бактериальных штаммов, обладающих различной степенью устойчивости ко многим препаратам (поли-резистентностью), делает особенно актуальными качественную (метод дисков) и количественную (метод серийных разведений) оценку чувствительности бактерий к лечебным препаратам.

План

Программа

Спектры действия основных групп антимикробных препаратов.

Оценка действия на бактерии антимикробных пре­паратов методом дисков.

Определение минимальной ингибирующей концент­рации (МИК) антимикробных препаратов методом се­рийных разведений.

Демонстрация

1. Антимикробные препараты различных групп.

Стандартные бумажные диски, пропитанные антими­кробными препаратами, для определения чувствитель­ности к ним бактерий.

Таблицы и схемы антимикробных спектров важней­ших групп антибиотиков и механизмы их антибакте­риального действия.

Задание студентам

Поставить опыт по определению чувствительности стафилококков к различным антибиотикам методом дисков.

По результатам поставленного опыта определить ми­нимальную ингибирующую концентрацию пеницил­лина для различных бактериальных культур методом серийных разведений.

Методические указания

Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведений. Дан­ный метод применяют для определения минимальной подав­ляющей концентрации (МПК) — наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бак­терий. Готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЁД/мл) в физиологическом или буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовле­ния серийных (2-кратных) разведений антибиотика в питатель­ной среде — бульоне (в объеме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плот­ности и засевают по 0,1 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль куль­туры). Посевы инкубируют при 37 °С 20—24 ч или более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подав­ляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.

Метод серийных разведений может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам любых микро­организмов, включая прихотливых и медленно растущих, а также облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий, риккетсий и вирусов). В последнем случае антимикробные пре­параты в различных концентрациях добавляют в среду для культивирования клеток, после чего клетки заражают чистой культурой тестируемого вируса или бактерии. Результат оцени­вают по ЦПД или с помощью серологических реакций, позво­ляющих обнаружить накопление антигенов возбудителя в за­раженных клетках (см. главу 10). Чаще всего с этой целью применяют иммунофлюоресцентный метод (ИФ). Наимень-Антибиотик МПК (мкг/мл) чувстви- промежу- устой-тельные точные чивые (S) (I) (R) Пенициллины Бензилпенициллин: • для стафилококков <0,12 — >0,25 • для других бактерий <1,5 >1,5 Оксациллин • для Staphylococcus aureus <2 — >4 • для других видов стафилококков <0,25 — >0,5 Метициллин <2 — >4 Ампициллин: • для стафилококков <0,25 — >0,5 • для E.coli и других энтеробактерий <8 16 >32 Карбенициллин: • для E.coli и других энтеробактерий <16 32 >64 • для Pseudomonas aeruginosa <128 256 >512 Пиперрациллин • для E.coli и других энтеробактерий <16 32 >64 • для Pseudomonas aeruginosa >64 — >182 Азлоциллин <64 — >128 Цефалоспорины Цефазолин <8 16 >32 Цефалотин <8 16 >32 Цефаклор <8 16 >32 Цефалексин <8 16 >32 Цефуроксим <8 16 >32

Антибиотик МИК (мкг/мл) чувстви- промежу- устой-тельные точные чивые (S) (I) (R) Цефамандол <8 16 >32 Цефотаксим <8 16—32 >64 Цефтриаксон <8 16—32 >64 Цефоперазон <16 32 >64 Цефтазидим <8 16 >32 Цефепим <8 16 >32 Новые бета-лактамы Имипенем <4 8 >16 Меропенем <4 8 >16 Хинолоны Налидиксовая кислота ^16 — >32 Ципрофлоксацин <1 2 >4 Офлоксацин <2 4 >8 Норфлоксацин <4 8 >16 Аминогликозиды Канамицин <16 32 >64 Гентамицин <4 8 >16 Тобрамицин <4 8 >16 Амикацин <16 32 >64 Нетилмицин <8 16 >32 Тетрациклины, макролиды, линкозамиды Тетрациклин <2 4—8 >1б Доксициклин ^4 8 >16 Эритромицин <0,5 1—4 >8 Азитромицин <2 4 >8 Кларитромицин <2 4 >8 Алеандомицин <2 >8 Линкомицин <2 4 >8 Клиндамицин <0,25 0,5 >1 Антибиотики других групп Хлорамфеникол (левомицетин) <8 16 >32 Фузидиевая кислота <2 4—8 >16 Рифампицин <2 4 >8 Полимиксин <50 ЕД/мл >:50 ЕД/мл Ванкомицин <4 8—16 >32 Фурадонин ^32 64 2:128

Микротест-системы для определения чувствительности к ан­тимикробным препаратам. Микротест-системы предназначены для быстрого определения клинической чувствительности к антибиотикам бактерий определенных видов или родственных групп. Тестируемые препараты в стандартных концентрациях находятся в лунках готовых пластиковых планшетов. Опреде­ляют чувствительность исследуемой культуры к двум концент­рациям каждого антибиотика: средней терапевтической и мак­симальной. Материал из изолированной колонии с помощью мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, и го­товят суспензию. Готовую бактериальную суспензию разлива­ют в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора, что позволяет существенно сократить сроки ис­следования. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в при­сутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма при­водит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельнос­ти микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.

Определение клинической чувствительности бактерий к анти­микробным препаратам методом дисков (диффузионный тест). Метод основан на подавлении роста бактерий на плотной питательной среде под действием антибиотика, содержащегося в бумажном диске. В результате диффузии препарата в агар вокруг диска образуется градиент концентрации антибиотика. Размер зоны подавления роста зависит от чувствительности бактерии и свойств препарата (в частности, скорости диффузии в агаре). Для определения чувствительности в клинической практике применяют готовые стандартные диски со строго определенным содержанием антибиотиков. Содержание пре­парата определяется исходя из терапевтических концентраций каждого антибиотика и средних значений МПК для патоген­ных бактерий. Название препарата и его количество обозначе­но на каждом диске. Для определения чувствительности из исследуемой бактериальной культуры готовят взвесь, содержа­щую стандартное количество жизнеспособных клеток, и засе­вают газоном в чашки Петри (диаметр 100 мм) на среды Мюллера-Хинтон или АГВ (специальные среды, не препятст­вующие диффузии антимикробных веществ и не оказывающие на них негативного воздействия). Диски на засеянную поверх­ность накладывают с помощью аппликатора на расстоянии 2,5 см от центра чашки по кругу (рис. 7.2.1). На чашку поме­щают не более 5 дисков. Посевы инкубируют 18—20 ч при 35 °С. При корректном выполнении процедуры на фоне рав­номерного бактериального газона вокруг дисков образуются

Антибиотик Диаметр зоны задержки роста (мм) чувстви- промежу- устой-тельные точные чивые (S) (I) (R) Пенициллины Бензилпенициллин: • при испытании стафилококков £20 21—28 >29 • при испытании других бактерий £10 11—16 £17 Ампициллин: • при испытании стафилококков £20 21—28 £29 • при испытании грамотрицатель-ных бактерий и энтерококков <9 10—13 >14 Карбенициллин (25 мкг) <14 15—18 >19 Карбенициллин (100 мкг) при испытании P. aeruginosa <11 12—14 £15 Метициллин £13 14—18 £19 Оксациллин (10 мкг) £15 16—19 £20 Азлоциллин (для P. aeruginosa} £13 14—16 £16 Пиперациллин (для P. aeruginosa) <17 — >18 Азтреонам <15 16—21 >22 Цефалоспорины Цефалотин £14 15—18 £19 Цефазолин <14 15—18 >19 Цефуроксим £14 15—18 >19 Цефокситин <14 15—18 £19 Цефотаксим <14 15—20 >21 Цефтриаксон £14 15—20 £21 Цефоперазон £14 15—18 £19 Цефтазидим £14 15—17 £18 Цефалексин £14 15—18 £19 Цефаклор £14 15—18 £19 Цефиксим £15 16—19 £20 Цефепим* <14 15-17 £18

Антибиотик Диаметр зоны задержки роста (мм) чувстви- промежу— устой -тельные точные чивые (S) (I) (R) Новые бета-лактамы Имипенем* <13 14—15 >16 Меропенем* <13 14—15 >16 Хинолоны Ципрофлоксацин <15 16—20 >21 Офлоксацин <12 13—16 >17 Налидиксовая кислота* <12 13—17 >18 Аминогликозиды Стрептомицин <16 17—19 >20 Канамицин <14 15—18 >19 Гентамицин <15 — >16 Сизомицин <15 — £16 Тобрамицин <14 — >15 Амикацин <14 15—16 >17 Нетилмицин <12 13—14 >15 Тетрациклины, макролиды, линкозамиды Тетрациклин <16 17—20 >22 Доксициклин <15 16—19 >20 Эритромицин <17 18—21 >22 Азитромицин <13 14—17 >18 Рокситромицин* <14 15—18 >19 Кларитромицин* <13 14—17 >18 Линкомицин <19 20—23 >24 Клиндамицин <14 15—20 >21 Олеандомицин <16 17—20 >21 Антибиотики других групп Хлорамфеникол <15 16—18 >19 Фузидиевая кислота <16 17—20 >21 Рифампицин <12 13—15 >16 Полимиксин <11 12—14 >15 Ванкомицин: • для стафилококков <11 — >12 • для энтерококков <14 15—16 >17 Ристомицин <9 10—11 >12 Фурадонин <15 16—18 >19 Фурагин <15 16—18 >19

Номер Разведение антибиотика Концентрация Рост бактерий пробирки антибиотика, (помутнение мкг/мл среды) 1 1:100 100 -2 1:200 50 -3 1:400 25 -4 1:800 12,5 -5 1:1600 6,25 + 6 1:3200 3,12 + 7 Среда без антибиоти- — + ка (контроль)

Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении по­лоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствую­щего шкале. Процедура определения чувствительности с помо­щью Е-теста осуществляется аналогично тестированию мето­дом дисков. После инкубации посева вокруг полоски образу­ется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е-теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные кри­терии (табл. 7.2.3).

Глава 8

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Введение. Экология микроорганизмов является разделом об­щей микробиологии и изучает взаимоотношения микро- и макроорганизмов, совместно обитающих в определенных био­топах. В естественных средах обитания (почве, воде, воздухе, живых организмах) микробы входят в состав различных био­ценозов. Экология микробов, вызывающих заболевания чело­века, определяется их способностью выживать во внешней среде, менять хозяев, сохраняться в организме хозяина на фоне действия иммунной системы, а также связана со способами их распространения, передачи и рядом других факторов. Оценка ряда экологических условий является одной из главных задач санитарной микробиологии.

Санитарно-бактериологические исследования лежат в осно­ве практической работы санитарных врачей и эпидемиологов при санитарно-гигиенической оценке объектов окружающей среды, пищевых продуктов, напитков и т.д. и играют ведущую роль в профилактике инфекционных болезней. Важным объ­ектом изучения медицинской микробиологии является нор­мальная микрофлора организма человека, которая включает микробы, обитающие на кожных покровах, слизистых оболоч­ках различных органов (полости рта, зева, носоглотки, верхних участков дыхательных путей, кишечника, особенно толстой кишки, и т.д.). Одни из них являются постоянными (облигат-ными) обитателями организма человека, другие — временными (факультативными или транзиторными). Нормальная микро­флора — это жизненно важная система организма, которая обеспечивает защиту от многих патогенных микробов, созре­вание и стимуляцию иммунной системы, продукцию ряда ви­таминов и ферментов, участвующих в пищеварении, и др.

Качественный и количественный состав микрофлоры человека меняется в течение жизни и зависит от пола, возраста, харак­тера питания и др. Кроме того, колебания в составе микро­флоры человека могут быть обусловлены возникновением заболеваний и применением лекарственных препаратов, преж­де всего антибиотиков и иммуномодуляторов. Оценка ка­чественного и количественного состава микрофлоры орга­низма человека по определенным показателям позволяет вы­явить его нарушение (дисбактериоз) и связанные с ним по­следствия.