Серологические реакции

Серологические реакции — реакции взаимодействия между антигеном и антителом протекают в две фазы: 1 фаза — специфическая — образование комплекса антигена и соответствующего ему антитела (см. рис. 33). Видимого изменения в этой фазе не происходит, но образовавшийся комплекс становится чувствительным к неспецифическим факторам, находящимся в среде (электролиты, комплемент, фагоцит); 2-я фаза— неспецифическая. В этой фазе специфический комплекс антиген — антитело взаимодействует неспецифическими факторами среды, в которой происходит реакция.

Результат их взаимодействия может быть видим невоору­женным взглядом (склеивание, растворение и т. п.). Иногда эти видимые изменения отсутствуют.

Характер видимой фазы серологических реакций зави­сит от состояния антигена и условий среды, в которой происходит его взаимодействие с антителом. Различают реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента и др.

Таблица № 11.

Серологические реакции в зависимости от участвующих в них компонентов и условий среды.

Реакции, происходя­щие в присутствии антител	Антигены, взаимодей­ствующие с антителами	Неспецифические компоненты реакции
Агглютинация Гемагглютинация	Бактерии Эритроциты	Электролиты (изотонический раствор)
Преципитация	Белки, экстракты органов и тканей; лизаты, гаптены	То же
Иммунный лизис: бактериолиз гемолиз цитолиз	Бактерии Эритроциты Другие клетки	Комплемент
Реакция связыва­ния комплемента	Гаптены, экстракты, лиза­ты, полные антигены, клетки
Нейтрализация	Токсины, вирусы	Электролиты
Фагоцитоз	Бактерии	Фагоциты

Применение серологических реакций. Одно из основных применений серологических реакций — лабораторная диаг­ностика инфекций. Их используют:

1) для выявления антител в сыворотке больного, т. е. для серодиагностики;

2) для определения вида или типа антигена, например выделенного от больного микроорганизма, т.е. для его идентификации.

При этом неизвестный компонент определяют по изве­стному. Например, для обнаружения антител в сыворотке больного берут известную лабораторную культуру микро­организма (антиген). Если сыворотка реагирует с ним, значит, она содержит соответствующие антитела и можно думать, что данный микроб является возбудителем болез­ни у обследуемого больного.

Если нужно определить, какой микроорганизм выде­лен, его испытывают в реакции с известной диагностиче­ской (иммунной) сывороткой. Положительный результат реакции говорит о том, что данный микроорганизм иденти­чен тому, которым иммунизировали животное для получе­ния сыворотки.

Таблица №12.

Применение серологических реакций

Цель исследования	Антиген	Антитело	Положительный результат реакции
Определение антител (серодиаг­ностика)	Известный (диагности-кум)	Сыворотка больного	В сыворотке больного есть анти­тела к известному антигену.
Определение антйгейа (иденти­фикация)	Неизвест­ный	Иммунная (ди­агностическая сыворотка)	Изучаемый анти­ген идентичен тому, которым иммунизи­ровали животное

Серологические реакции применяют также для определения активности (титра) сывороток и в научных исследо­ваниях .

Проведение серологических реакции требует особой подготовки.

Посуда для серологических реакций должна быть чистой и сухой. Применяют пробирки(бактериологиче­ские, агглютинационные, преципитационные и центрифуж­ные), пипетки градуированные разного размера и пасте­ровские, колбы, цилиндры, предметные и покровные стекла, чашки Петри, пластины из пластмассы с лунками.

Инструменты и оборудование: петля, штативы, лупа, агглютиноскоп, термостат, холодильник, центрифу­га, весы химические с разновесом.

Материалы: антитела (иммунные и исследуемые сыворотки), антигены (культуры микроорганизмов, диагностикумы, экстракты, лизаты, гаптены, эритроциты, токсины), комплемент, изотонический раствор натрия хлорида.

В серологических реакциях применяют только химиче­ски чистый натрия хлорид.

Сыворотки. Сыворотка больного. Сыворотку обычно получают на второй неделе болезни, когда можно ожидать наличие в ней антител, иногда пользуются сыворотками реконвалесцентов (выздоравливающих) и пе­реболевших.

Чаще всего для получения сыворотки кровь берут из вены в количестве 3—5 мл в стерильную пробирку и направляют в лабораторию, сопровождая этикеткой, с указанием фамилии и инициалов больного, предполагаемо­го диагноза и даты.

Кровь следует брать натощак или не раньше, чем через 6 ч после еды. В сыворотке крови после еды могут содержаться капельки жира, которые делают ее мутной и непригодной для исследования (такая сыворотка называет­ся хилезной).

Внимание! При взятии крови необходимо соблюдать правила асептики.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 ч при комнатной температуре или ставят в термостат при 37 °С на 30 мин для образования сгустка:

Не следует держать сыворотку в термостате больше
30 мин_____ может произойти гемолиз, что помешает проведению исследований.

Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой или петлей («обводит»). Пробирку помещают в холодильник на некоторое время (обычно 1 ч, но не более 48 ч) для лучшего отделения сыворотки из сжавшегося на холоде сгустка. Затем сыворотку отсасы­вают стерильной пастеровской пипеткой, снабженной ре­зиновым баллоном или шлангом.

Отсасывать сыворотку следует очень осторожно, что­бы не захватить форменные элементы. Сыворотка должна быть совершенно прозрачной без примеси клеток. Мутные сыворотки еще раз отсасывают после того, как клетки осядут. Сыворотку можно освободить от форменных элементов центрифугированием.

На сгустке сыворотка может оставаться не более 48 ч при +4°С.

Для получения сыворотки кровь можно брать из прокола мякоти пальца или мочки уха пастеровской пипеткой. У грудных детей кровь берут из У-образного разрезе на пятке.

При использовании пастеровской пипетки кровь насасывают в пипетку из прокола. Острый конец пипетки запаивают. Пипетку помещают в пробирку острым концом вниз. Чтобы он не сломался, на дно пробирки кладут кусочек ваты. Пробирку с соответствующей этикеткой направляют в лабораторию. Скопившуюся в широком конце пипетки сыворотку отсасывают.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определенной схеме соответствующим антигеном (вакциной). В полученной сыворотке определяют ее активность (титр), т. е. наибольшее разведение, в котором она реагирует с соответствующим антигеном в определенных условиях опыта.

Готовят сыворотки крови обычно на производстве. Их разливают в ампулы, на которых указывают название и титр. В большинстве случаев сыворотки высушивают. Сухую сыворотку перед употреблением растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема (тоже указан на этикетке). Хранят все сухие (лиофилизированные) диагностические препараты при 4 - 10˚С.

Для серологических исследований применяют иммунные сыворотки нативные (не адсорбированные) и адсорбированные. Недостаток нативных сывороток – наличие в них групповых антител, т.е. антител к микроорганизмам, имеющим общие антигены. Обычно такие антигены встречаются у микробов, принадлежащих к одной группе, роду, семейству. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью: реагируют только с гомологичным антигеном. Антитела к другим (гетерогенным) антигенам удалены адсорбцией. Титр антител адсорбированных сывороток низкий (1:40, 1:320), поэтому их не разводят.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (РА) – это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора натрия хлорида). Образовавшийся осадок называют агглютинатом. Для реакции необходимы:

1. Антитела (агглютинины) – находятся в сыворотке больного или иммунной сыворотке.

2. Антиген – взвесь живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический раствор.

Реакцию агглютинации для серодиагностики широко применяют при брюшном тифе, паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта) и др. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном – известный микроб.

При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом – известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют при диагностике кишечных инфекций, коклюша и др.

Подготовка ингредиентов: 1) получение сыворотки см. с. 200; 2) приготовление антигена. Взвесь живых микробов должна быть гомогенной и соответствовать (в 1 мл) примерно 30 ед. мутности по оптическому стандарту ГИСК. Для ее приготовления обычно используют 24-часовую культуру, выращенную на скошенном агаре. Культуру смывают 3-4 мл изотонического раствора, переносят в стерильную пробирку, определяют ее густоту и, если нужно, разводят.

Применение взвеси убитых микробов – диагностикумов – облегчает работу и делает ее безопасной. Обычно пользуются диагностикумами, приготовленными на производстве.

Постановка реакции. Существует два метода проведения этой реакции: реакция агглютинации на стекле (иногда ее называют ориентировочной) и развернутая реакция агглютинации (в пробирках).

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят 2 капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора.

Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 – 1:25. Капли на стекло наносят так, чтобы между ними было расстояние. Восковым карандашом на стекле помечают, где какая капля. Культуру петлей или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического раствора и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки крови в каплю изотонического раствора, которая является контролем антигена.

Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, а в контроле антигена должна наблюдаться равномерная муть. Если в капле, где культура смешана на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считают положительным. При отрицательном результате реакции в капле будет равномерная муть, как в контроле антигена.

Реакция отчетливее видна, если ее рассматривать на темном фоне в проходящем свете. При ее изучении можно пользоваться лупой.