Порядок работы с микроскопом

ЧАСТЬ I

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ

ЗАНЯТИЕ 1

Дата________________

Тема: ВВЕДЕНИЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЛАБОРАТОРИЮ. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

План занятия

1.Знакомство с рабочим местом и режимом работы в микробиологической лаборатории.

2.Знакомство с иммерсионным микроскопом и правилами работы с ним.

3.Упражнение в микроскопии на готовых препаратах с приме­нением сухих и иммерсионной систем.

4.Правила обращения с культурами микробов.

5.Приготовление препарата "раздавленная капля".

6.Приготовление и окраска препарата тушью по Бурри (негативный способ окраски).

7.Знакомство со специальными методами микроскопии (люминесцентная микроскопия).

Методические указания

§ I. а) Оборудование рабочего места.

На рабочем столе должно быть все необходимое для работы: микроскоп, иммерсионное масло, бактериологическая петля, спиртовка, набор красок, промывалка и ванна для промывки препаратов, предметные стекла и салфетки для протирания их, штатив для пробирок с культурами, пинцет, фильтровальная бумага для высушивания препара­тов и банка для отработанных стекол.

Из личных вещей студента на рабочем месте допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой делают записи и зарисовки. Ничего лишнего (в том числе учебников и других книг) на рабочем столе не должно быть.

б) Режим работы в бактериологической лаборатории.

Работа с болезнетворными микробами требует обязательного соблюдения ряда правил личной и общественной профилактики. Каждый студент обязан работать в халате, на голову надевать шапочку или косынку, не курить и не принимать пищу в лаборатории, избегать суеты. По окончании работы необходимо вымыть руки с мылом.

§ 2. Важнейшей характеристикой каждого объектива микроскопа является его разрешающаяся способность. Разрешающей способностью называется расстояние между двумя точками, при котором они еще видны раздельно (т.е. не сливаются в одну). Разрешающая способ­ность объектива ограничивается такими недостатками оптической сис­темы, как сферическая и хроматическая аберрации ,дифракция и т.д. Если первые два явления устранимы, то явление дифракции имеет мес­то в любой оптической системе. Оно ограничивает разрешающую способ­ность оптических систем. Разрешающая способность объектива с уче­том явлений дифракции описывается следующей формулой:

А = 0,61 ,

где А - минимальное расстояние между двумя точками объекта (разрешающая способность);

n - показатель преломления среды между препаратом и фронталь­ной линзой объектива (в случае масляной иммерсии n=1,51);

α- угол между оптической осью объектива и наиболее крайним лучом, попадающим в объектив из центра препарата;

λ- длина световой волны;

0,61 - коэффициент, который учитывает геометрические факторы при вычислении освещенности первого дифракционного максимума от круглого отверстия.

Величина n·Sinα постоянна для каждого объектива и называется числовой, или нумерической, апертурой. Она выгравирована на опра­ве объектива. В монобромнафталиновых иммерсионных объективах нумерическая апертура может варьировать в пределах от 1,25 до 1,60. При наличии воздуха между фронтальной линзой и покровным стеклом нумерическая апертура не превышает 0,95.

Из приведенной выше формулы видно, что разрешающая способность объектива прямо пропорциональная его числовой апертуре и об­ратно пропорциональна длине волны света, используемого при микроскопии. При микроскопии в видимом свете с длиной волны порядка 0,55 микрона и иммерсионным объективом с максимальной нумерической апертурой 1,60 разрешающая способность равна:

А = 0,61

Величина угла, при котором глаз способен различать раздельно две точки, называется углом резкого зрения. Для получения на сетчатке раздельного изображения двух точек световые лучи должны попасть в глаз под углом зрения, который стягивает дугу от 2 до 4 минут.

Изображение структур, разрешенных объективом, может быть увели­чено окуляром лишь настолько, чтобы оно просматривалось под углом, стягивающим дугу величиной от 2 до 4 минут. Это - полезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение микроскопа не может превышать числовую апертуру более чем в 1000 раз. Поэтому максимальное полез­ное увеличение для микроскопов, имеющих иммерсионные объективы с апертурой 1,4-1,6, составляет 1400-1600. Применение в таких микроскопах более сильных окуляров никаких дополнительных деталей к структуре препарата, разрешаемой объективом, не выявляет.

Для полного использования разрешающей способности иммерсионного объектива необходимо выполнять следующие основные правила:

1)Конденсор осветительного аппарата должен быть поднят до отказа (до уровня предметного столика).

2)Диафрагма конденсора должна быть полностью открыта.

3)Во всех без исключения случаях работа ведется с плоским зеркалом, так как конденсор рассчитан на работу с параллельными пучками света.

Наряду с увеличением и нумерической апертурой одной из важных характеристик объектива является его свободное рабочее расстояние, т.е. расстояние между верхней поверхностью препарата и нижней поверхностью фронтальной линзы объектива при наведенном на фокус объективе. Эти расстояния следующие:

для объектива с увеличением х8 - 8,5 мм;

для объектива с увеличением 40х - 0,4 мм;

для объектива с увеличением 90х - 0,2 мм.

Знание этих расстояний необходимо для того, чтобы быстро сфокусировать микроскоп на препарате. Кроме того, чтобы правильно и быстро установить освещение, необходимо, чтобы объектив находился от препарата на свободном рабочем расстоянии.

Порядок работы с микроскопом

1.Проверить состояние осветительного аппарата (поднять кон­денсор, открыть его диафрагму, поставить плоское зеркало).

2.Положить на столик микроскопа исследуемый препарат и поставить слабый сухой объектив (8x) на расстояние несколько меньше свободного рабочего расстояния (для данного объектива 5-7 мм).

Рис.1 Дрожжевые клетки объектив 8x

Рис.2 Дрожжевые клетки объектив 40x

Рис.3 Дрожжевые клетки объектив 90x

3. Глядя в окуляр и вращая зеркалом, произвести предварительную установку освещения,

4. Медленно поднимая тубус макровинтом, добиться резкого изображения препарата. При использовании слабого сухого объектива в поле зрения, кроме препарата, может быть видно изображение источ­ника света, т.е. оконной рамы и других предметов, находящихся за окном.

5.Движением зеркала поставить в центре поля зрения наиболее светлый участок оконной рамы (например, участок неба с облаками), после чего можно переходить на микроскопию с сильным сухим или иммерсионным объективами. При этом мешающие детали исчезают из поля зрения, Если этого не происходит, то следует осторожно приподнять или опустить конденсор на 1-1,5 мм.

6.Поставив сильный сухой или иммерсионный объектив, ни в коем случае нельзя опускать тубус микроскопа, глядя в окуляр. Необходимо под контролем глаза, глядя сбоку, опустить объектив на расстояние меньше свободного рабочего, а затем, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока появится мелькание препарата. После этого точная установка достигается с помощью микровинта. Не следует делать микровинтом более половины оборота в одну или другую сторону. При фокусировке микроскопа полезно левой рукой слегка двигать препарат по поверхности предметного столика.

§ 3. Пользуясь изложенными сведениями, необходимо научиться быстро и правильно устанавливать препарат в Фокусе при всех трех объективах. Рассматривая препарат, следует обратить внимание на резкое увеличение числа разрешаемых подробностей при работе с иммерсионным объективом по сравнению с сухими объективами.

Зарегистрировать рабочий номер своего микроскопа и указать в таблице его основные параметры.

Рис.4. Микроскоп Обозначения: 1 - окуляр; 2 - тубус; 3 -штатив(колонка и ножка);4- макрометрический винт; 5- микрометрический винт;6- зеркало; 7 - конденсор;8- предметный столик;9- объектив; 10 – револьвер.

Параметры рабочего микроскопа.

Тип (марка)______________

Заводской номер_________

Увеличение окуляра______

Номера объективов: 8x____

40x___

90x___

Нумерическая апертура

объективов: 8x____

40x___

90x___

Общее увеличение

с объективом 90x___

Порядковый номер____

Роспись_____________

§ 4. Необходимо твердо усвоить основные приемы бактериологической техники: обращение с культурами микробов, использование бактериологической петли, спиртовок, способы обеззараживания использованного материала и отработанных стекол.

При работе с культурами микроорганизмов необходимо соблюдать следующие два основные принципа: 1 - не загрязнить микробами окружающей среды и не заразить самого себя и 2 - не загрязнить культуру посторонними микробами из окружающей среды, так как точная идентификация исследуемого возбудителя заболевания возмож­на лишь при условии выделения и сохранения его в чистой культуре.

Культуру бактерий сохраняют обычно на жидких и плотных питательных средах в пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками. При всех манипуляциях с культурой (приготовление мазка, пересев ее с одной среда на другую и т.д.) используют стерильную бакте­риологическую петлю из металлической проволоки. Правильно приготовленная петля диаметром от I до 5 мм должна быть полностью замкнута и не должна тлеть лишнего свободного конца. Петлю стерилизуют прокаливанием докрасна в пламени горелки, держа ее сначала вертикально, затем проводят 3-4 раза через пламя прилегающую к петле часть петледержателя.

Для соблюдения вышеуказанных принципов в случае приготовления бактериологическую петлю берут в правую руку как ручку или карандаш, а пробирку держат в левой руке между большим и указательным пальцами с тыльной стороны кисти почти в горизонталь­ном положении. При этом должна быть хорошо видна поверхность питательной среды с культурой бактерий.

Простерилизовав петлю, правой рукой захватывают пробку, прижимая ее мизинцем к ладони, освобождают ее небольшим поворотом, вынимают над пламенем горелки и, не выпуская пробку из руки (в таком положении она сохраняется в течение последующих манипуляций) обжигают края пробирки. Петлю вводят в пробирку, остужают прикосновением к внутренней стороне стекла и берут ею небольшое коли­чество культуры, стараясь не захватить при этом питательной среды. Вынув петлю, опять обжигают края пробирки, слегка обжигают пробку и закрывают ею пробирку. Не выпуская петли из руки, ставят пробирку в штатив и приступают к приготовлению мазка. После этого пет­лю стерилизуют и ставят в штатив.

С соблюдением этих основных правил производят и все другие манипуляции с культурами бактерий - пересев из пробирки в пробирку» из пробирки в чашку, из чашки в чашку и т.п.

В случае попадания культуры микробов на руки, другие предметы и пол необходимо немедлено протереть руки и загрязненные предметы ватой, смоченной дезинфицирующим растворов, а пол залить этим же раствором. Через 30 минут руки можно вымать с мылом.

§ 5. На чистое сухое предметное стекло нанести с помощью бактериологической петли каплю воды. Прокаленной и остуженной петлёй внести в небольшое количество (одну петлю) микробной массы и равномерно перемешать с водой. Петлю прокалить и поставить в штатив. Накрыть каплю чистым покровным стеклом и придавить его слегка рукояткой петли. Полученную "раздавленную каплю" поместить на предметный столик микроскопа и промикроскопировать сначала со слабым сухим объективом, затем с сильным сухим объективом и, наконец, с иммерсионным. Для установки препарата в фокусе следует найти вначале при малом увеличении капли, вывести его в центр поля зрения и затем по нему ориентироваться.

При микроскопии необходимо помнить, что рассматривание неокрашенного препарата возможно только с ограниченным освещением, что достигается опусканием конденсора или уменьшением отверстия ирис-диафрагмы,

§ 6. На чистое предметное стекло наносят каплю воды и рядом с ней несколько больших размеров каплю туши. В каплю воды вносят небольшое количество исследуемой культуры (получается облачко помутнения). Прокалив и остудив петлю(чтобы сжечь оставшуюся массу бактерий), готовят равномерную взвесь бактерий. Затем соединяют эту каплю с каплей туши, тщательно перемешивают и размазывают по стеклу тонким слоем. Высушивают мазок на воздухе и микроскопируют с иммерсионным объективом.

При микроскопии препарата рекомендуется начинать с более светлых участков его, а затем переходить на более темные. Необходимо помнить, что при негативных способах окраски микробы остаются не убитыми.

§ 7. Метод люминесцентной микроскопии.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, то он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цветов.

Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специаль­ными (светящимися) люминесцентными красителями - флуорохромами (например, раствор акридинового оранжевого 1:5000 - 1:10000). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускаются через сине-фиолетовый фильтр. Под действием

Рис.5 Стрептобацилла (“Раздавленная капля”)

Рис.6 Негативная окраска по Бури; объектив 90x

Рис.7 Люминесценция дрожжей, обработанных акридиновым оранжевым; объектив 40x

Рис.8 Оптическая схема люминесцентного микроскопа

этого коротковолнового излучения окрашенные акридиновым оранжевым бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того, чтобы синий свет, вызывающий люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром микроскопа ставят "запирающий" желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающие желтые, зеленые и красные лучи.

В результате при наблюдении в микроскопе на темном фоне будут видны микробные клетки, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. При окраске акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом, а находящаяся в цитоплазме рибонуклеиновая кислота - красным цветом.

Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными растворами красителей, не причиняющих вреда микробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Метод с большим эффектом может -быть использован для ускорения диагностики ряда заболеваний.

Флуоресцирующими красителями можно обрабатывать диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенным бактериям. Краситель, например, изотиоцианат флуоресцеина, химически соединяется с глобулинами иммунной сыворотки и таким образом как бы избиратель­но метит антитела.

Люминесцирующие сыворотки могут быть использованы для идентификации выделенных культур бактерии и для ускоренной индикации патогенных микробов во внешней среде и в выделениях больных.

Сущность иммунофлуоресцентного метода исследования заключается в том, что из исследуемого материала готовят мазок и после высушивания и фиксации обрабатывают его люминесцирующей сывороткой (см. занятие 12). При наличии в исследуемом мазке гомологичных бактерий, вследствие адсорбции на них меченных флуоресцирующим краси­телем антител, в люминесцентном микроскопе на темном фоне препарата обнаруживается специфическое яркое желто-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток. Центральная часть клеток не светится. Присутствующие в препарате посторонние микробные клетки не светятся.

Демонстрация в люминесцентном микроскопе бактерий, обработан­ных акридиновым оранжевым и люминесцирующей сывороткой.

Контрольные вопросы

От чего зависит разрешающая способность микроскопа?

Почему иммерсионные объективы имеют более высокую разрешающую способность по сравнению с сухими объективами с тем же отверстным утлом?

Что такое нумерическая апертура и по какой формуле она определяется?

Чему равны разрешающая способность современных оптических микроскопов и их полезное увеличение?

На какой высоте должен находиться при микроскопии конденсор?

Каким зеркалом следует пользоваться при работе на микроскопах, снабженных конденсором?

Чему равны свободные рабочие расстояния объективов микроскопов и для чего необходимо их знать?

Каким винтом микроскопа следует производить наводку на рез­кость?

Как следует производить наводку" микроскопа на резкость, чтобы избежать повреждения объектива и препарата?

Как выявить наличие загрязнения в окуляре?

Как правильно приготовить бактериологическую петлю?

Как следует держать пробирку, петлю и пробку при взятии ма­териала для приготовления препарата?

Как предохранить культуру микроорганизма от загрязнения из воздуха?

Как производится негативная окраска препарата по Бурри?

Как выглядят бактерии в препарате, приготовленном по Бурри?

Как должно быть установлено освещение при микроскопии неокра­шенных препаратов ("раздавленная капля")?

Как устроен люминесцентный микроскоп?

Каким светом наиболее целесообразно вызывать люминесценцию препарата и почему?

Каково назначение желтого окулярного светофильтра в люминесцентном микроскопе?

Что такое флуорохромирование, какие флуорохромы чаще приме­няются?

В чем заключается принцип иммунофлуоресцентного метода иссле­дования?