Удерживающая способность стерилизующего фильтра

Стерилизующий фильтр: размер пор – 0,2 (0,22) мкм.

Почему не 0,45 мкм?

• В природе встречаются мелкие микробные клетки с размером менее 0,5 мкм (например, микоплазмы). В природных популяциях такие клетки представлены очень слабо и в среднем составляют менее 1% от «обычных» бактериальных сообществ.

• Клетки многих бактерий в угнетенном состоянии при определенных условиях могут значительно уменьшаться в размерах – до 0,2 – 0,3 мкм по сравнению со стандартным размером – 0,5 – 2,0 мкм; Поэтому для проверки удерживающей способности стерилизующего фильтра используют клетки одной из самых мелких «классических» бактерий – Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta:

• Размер клеток, выращенных в стандартных условиях: 0,3 – 0,4 мкм (ширина), 0,6 – 1,0 мкм (длина).

• Суспензия таких клеток считается международным промышленным стандартом микробиологических модельных загрязнений для определения эффективности удерживающей способности на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм.

• Для проведения валидации процесса стерилизующей фильтрации используют культуру Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta АТСС 19146 из американской коллекции типовых культур или другой коллекции контрольных культур (NCIMB 11091, CIP 103020). Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta Ранее относились к роду Pseudomonas. На основании анализа структуры клеточных белков, состава жирных кислот, последовательности генов рРНК, соотношения оснований ДНК и степени родства ДНК классифицированы в отдельный род - Brevundimonas.

Характеристика.

• Одиночные подвижные аэробные неспорообразующие грамотрицательные мелкие палочки 0,3 – 0,4 мкм (ширина), 0,6 – 1,0 мкм (длина), с полярно расположенным единственным жгутиком.

• Экология: окружающая среда – воздух, вода. Не считается патогеном, но известны случаи выделения из клинического материала.

• Нуждаются в органических факторах роста: пантотенате, биотине, цианкобаламине, метионине или цистине.

• Не ферментируют ряд углеводов (глюкозу, лактозу и др.). Оксидаза- положительны.

• Оптимальная температура роста – 30 -35°С Коммерческие препараты культуры:

• Лифилизированный микроорганизм в форме желатиновых или лиофилизированных дисков (гранул, таблеток), упакованных во флакон.

• Флакон содержит осушитель с целью предотвращения скопления влаги.

• Условия хранения - от +2 о С до +8 о С (или при других условиях, оговоренных руководством по работе со штаммом).

В целях использования для валидации процесса стерилизующей фильтрации культуру выращивают на жидкой и агаризованной среде на основе гидролизата казеина и соевых бобов (соево-казеиновый агар – СКА и соево- казеиновый бульон - СКБ). На агаризованной среде СКА колонии округлые, выпуклые, гладкие, глянцевые, с ровным краем. Цвет колоний – светло- бежевый, иногда с серовато-желтым оттенком. На 24 ч. роста колонии становятся видимыми, точечными. На 48 ч. роста диаметр колоний 2,0 - 2,5 мм; на 72 ч. роста – 3,0 - 3,5 мм.

Восстановление культуры

• Перед началом работы с культурой в желатиновых или лиофилизированных дисках (гранулах, таблетках) закрытый флакон с культурой достают из холодильника и выдерживают 15 – 20 мин. при комнатной температуре, чтобы при открытии не произошло конденсации воды во флаконе.

• Стерильным пинцетом достают один диск (гранулу, таблетку) и помещают в 0,5 – 1,0 мл стерильной жидкости (раствор натрия хлорида изотонический, СКБ). Флакон немедленно закупоривают и возвращают в место хранения (+2 о С - +8 о С).

• Диск (гранулу, таблетку) суспендируют, из полученной суспензии стерильной микробиологической петлей делают посев истощающим штрихом на СКА в чашке Петри до получения изолированных колоний. Чашки Петри инкубируют при 30 - 35 о С в течение 48 – 72 ч.

• По истечении срока инкубирования определяют макроскопические и микроскопические характеристики.

– Макроскопические характеристики: визуально

– Микроскопические характеристики: с использованием светового микроскопа, имеющего калиброванный окуляр-микрометр рассматривают микроорганизмы в нескольких полях зрения микроскопа для оценки их размеров и расположения. Дополнительно готовят окрашенный препарат для подтверждения принадлежности к грамотрицательным бактериям и идентификации жгутиков

- Физиолого-биохимическая идентификация.

Поддержание культуры

• Изолированные колонии пересевают на скошенную агаризованную среду СКА в пробирках и инкубируют в течение 48-72 ч. при температуре 30 - 35 о С.

• Выросшую культуру хранят при температуре от +2 о С до +8 о С не более 7 суток. По истечении указанного времени хранения культуру пересевают на скошенную агаризованную среду СКА в пробирках. Инкубируют и хранят аналогичным образом.

• Количество пассажей не должно превышать пяти. Фильтр классифицируется как стерилизующий, если он выдерживает бионагрузку в виде клеток Brevundimonas diminuta в количестве не менее 10 7 КОЕ/см 2 эффективной площади фильтра и обеспечивает стерильный поток на выходе.

Бионагрузка (биологическая нагрузка) – популяция жизнеспособных микроорганизмов в жидкости до стадии стерилизующей фильтрации. Концентрация Brevundimonas diminuta 10 7 КОЕ/см 2 эффективной площади фильтра – биологическая нагрузка (провокационная нагрузка, микробный вызов).

Почему 10 7 КОЕ/см 2 ?

Фильтр может иметь некоторое количество более крупных пор по сравнению с номинальным размером и потенциально может пропускать микроорганизмы. Вероятность такого пропускания увеличивается по мере повышения бионагрузки в фильтруемом материале.

Реальная бионагрузка растворов ЛС, подлежащих фильтрации, как правило, не содержит микроорганизмы меньших размеров и в большей концентрации, чем провокационная нагрузка, применяющаяся при валидационных испытаниях. В большинстве случаев считается допустимой концентрация микроорганизмов в стерилизуемой жидкости 10 КОЕ/100 мл.

Проверка удерживающей способности стерилизующего фильтра проводится с учетом реальных условий производства лекарственного средства:

• Путем инокуляции суспензии микроорганизма в раствор конкретного лекарственного средства (прямая инокуляция), т.к. его компоненты могут оказывать воздействие как на материал фильтра, так и на микроорганизм. Допускается использовать 10% от реального объема стандартной серии препарата.

• В течение времени фильтрации объема стандартной серии ЛС

• При давлении и скорости потока, соответствующих таковым в условиях реального производства ЛС

• С учетом температуры фильтрации (если температура раствора ЛС не оказывает влияния на жизнеспособность тест-микроорганизма) Прямая инокуляция суспензии Вrevundimonas diminuta в ЛС позволяет оценить эффект ЛС на материал фильтра и микроорганизм. Однако, прямая инокуляция часто невозможна из-за антимикробных свойств ЛС в отношении тест- микроорганизма.

Поэтому до проведения валидационных испытаний необходимо определить наличие/отсутствие антимикробного действия ЛС в отношении Вrevundimonas diminuta.