Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации (РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных при постановке РГА.

Поставка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки в последовательных двукратных разведениях от 1:10 до1:2560 смешивают с равным объемом материала, содержащего вирус, разведенного в 4 раза меньше титра, установленного в РГА. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 мин, после чего добавляют по 0,5 мл 1-2% взвеси эритроцитов.

Реакцию сопровождают 3 контролями.

Учет результатов производят после второй инкубации в термостате 30 или 45 мин при комнатной температуре. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» - вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

В опыте, если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» - сыворотка нейтрализовала вирус. Титр сыворотки – это ее максимальное разведение, в котором происходит задержка гемагглютинации.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приоб­ретают способность агглютинироваться при взаимодей­ствии с антителами к адсорбированному антигену. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10—1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Рис.70 Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

А — получение эритроцитарного диагностикума; Б —РПГА: 1—эритроцит: 2 — изу­чаемый антиген: 3 — эритроцитарный диагностикум; 4 — антитело к изучаемому антигену; 5 — агглютинат.

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммун­ной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РНГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

В реакции преципитации происходит выпадение в оса­док специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, (аптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реак­ции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для опреде­ления антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине — для опреде­ления видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях — при установле­нии фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) — иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию.
Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5—1:10.

2. Антиген — растворенные вещества белковой или
липоиднополисахаридной природы (полные антигены и
гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципита­ции, должны быть совершенно прозрачными.

Рис.71 Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации ; Б - реакция преципитации по Оухтерлони

Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 — 0,3 мл (5—6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторож­но наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Про­бирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» — преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустит­ся на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Схема постановки реакции кольцепреципитации

Таблица №13

	Пробирки
Ингредиенты, мл	опыт	контроль
Иммунная сыворотка Нормальная сыворотка Испытуемый антиген Антиген одноименный иммунной сыворотке Чужеродный антиген Изотонический раствор	0,3 0,3	од 0,3	0,3 0,3	0,3 0,3	0,3 0,3
Результат	+ или-	+	-	-	-

Примечание. + наличие «кольца»; - отсутствие «кольца».

Учет результатов производят через 5—30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. «Кольцо» во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфиче­скую реакцию с соответствующим антигеном. В 3—5-й пробирках «колец» не должно быть — там нет соответству­ющих друг другу антител и антигенов. «Кольцо» в 1-й пробирке — положительный результат реакции — говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой им­мунной сыворотке, отсутствие «кольца» («кольцо» только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии — отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсут­ствие полосы свидетельствует о несоответствии компонен­тов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изу­чении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции
преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).