Определение чувствительности к антибиотикам
Используют стандартный диско-диффузионный метод, предложенный Керби и Бауэром (метод Керби – Бауэра). В качестве примера приводим рекомендуемый набор дисков с антибиотиками и критерии учета полученных результатов для стафилококков (табл. 1, 2). Средой для постановки теста на чувствительность является среда Мюллера – Хинтона с добавлением 4 – 5% NaCl.
Таблица 1. Набор дисков с антибактериальными препаратами и диаметр зон ингибирования роста для определения чувствительности штаммов стафилококка при отрицательном результате определения бета-лактамаз
| Антибактериальный препарат | Диск/ концентрация | Диаметр ингибирования зон | ||
| R | I | S | ||
| Оксациллин | ОХ/1 | <10 | 11-12 | >13 |
| Бензилпенициллин | P/1O | <28 | - | >29 |
| Ампициллин | AM/10 | <28 | - | >29 |
| Цефазолин | CZ/30 | <14 | 15-17 | >18 |
| Примечание. Здесь и в табл. 2: R - устойчивые; I - промежуточные; S - чувствительные. |
Таблица 2. Набор дисков с антибактериальными препаратами и диаметр зон ингибирования роста для определения чувствительности штаммов стафилококка при положительном результате определения бета-лактамаз
| Антибактериальный препарат | Диск/ концентрация | Диаметр ингибирования зон | ||
| R | I | S | ||
| Оксациллин | ОХ/1 | <10 | 11-12 | >13 |
| Эритромицин | E/15 | <13 | 14-22 | >23 |
| Клиндамицин | CM/2 | <14 | 15-20 | >21 |
| Ко-тримоксазол | CXT | <10 | 11-15 | >16 |
| Фузидиевая кислота | FA/10 | <15 | 16-21 | >22 |
| Ванкомицин | VA/30 | - | - | >15 |
| Амоксициллин/клавуланат | AmC/30 | <19 | - | >20 |
| Цефуроксим | CXM/30 | <14 | 15-22 | >23 |
Для определения чувствительности стафилококков предварительно проводят определение наличия/отсутствия у тестируемого штамма ферментов, получивших название "бета-лактамаз" – диск с нитроцефином (BBL, США). При отсутствии данных ферментов используют диски. При наличии у тестируемого штамма данных ферментов необходимо использовать диски, представленные в табл.2. Предлагаемый подход к тестированию чувствительности штаммов стафилококка важен для правильной интерпретации полученных результатов чувствительности:
1. При отсутствии бета-лактамазообразования и сохранении чувствительности к оксациллину препаратами выбора являются природные аминопенициллины и цефалоспорины I поколения.
2. При наличии бета-лактамазообразования и сохранении чувствительности к оксациллину препаратами выбора являются оксациллин, защищенные пенициллины, цефалоспорины II поколения.
3. При наличии бета-лактамазообразования и отсутствии чувствительности к оксациллину бета-лактамные антибиотики (включая карбапенемы) являются клинически не эффективными. Применяются препараты других групп.
Стрептококки (в том числе пневмококк). Для этих микроорганизмов метод
Керби – Бауэра имеет свои ограничения:
1. Он корректен лишь для пневмококка. И только в том случае, если тот показывает чувствительность к оксациллину (нагрузка 1 мкг). В случае снижения чувствительности к оксациллину необходимо использовать метод Е-теста или серийных разведений.
2. При использовании метода Керби – Бауэра для тестирования стрептококков в среду Мюллера – Хинтона необходимо добавлять 5% бараньей крови/эритроцитов.
3. Стрептококки группы "viridans" не рекомендуется тестировать на чувствительность к антибиотикам этим методом из-за отсутствия воспроизводимых результатов.
Псевдомонады и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии. Ограничения диско-диффузионного метода:
1. Стандартизован лишь для синегнойной палочки и бактерий рода Аcinetobacter.
2. При исследовании чувствительности других псевдомонад и неферментирующих грамотрицательных бактерий необходимо использовать Е-тест или метод серийных разведений.
Гемофильные палочки.
Ограничения диско-диффузионного метода:
1. Для постановки чувствительности диско-диффузионным методом должна использоваться специальная среда – HTM (Haemophilus Test Medium).
Дрожжеподобные грибы рода Кандида и др
Ограничения диско-диффузионного метода:
1. Используется специальные среды – казитоновый агар и полусинтетический агар для тестирования грибов.
2. Более достоверные результаты получаются при использовании метода серийных разведений.
Таким образом, резюмируя сказанное, можно сделать следующие выводы:
− При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов энтеробактерий и стафилококков рекомендуется использовать метод Керби – Бауэра.
− При определении чувствительности к антибактериальным препаратам штаммов стрептококков (в том числе пневмококка), неферментирующих грамотрицательных палочек, гемофильных палочек и дрожжеподобных грибов рекомендуется использовать коммерческие тест-системы ("стрипы"), представляющие собой набор тех или иных антибиотиков, представленных в двух концентрациях. Это метод (breakpoint) позволяет избежать трудоемкости стандартного метода серийных разведений, но не теряет при этом его главного достоинства – количественного определения минимальной подавляющей концентрации препарата, соответствующей терапевтической концентрации антибиотика в организме.
Отдельно подчеркиваем особенности микробиологической диагностики легионелл, микоплазм и хламидий.
− Легионеллезы в настоящее время микробиологически диагностируются с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) на определение антигена.
− Первичная атипичная пневмония (микоплазменная) также микробиологически подтверждается с помощью ИФА выявление антител (IgG , IgM).
− Хламидийные пневмонии диагностируются микробиологически как РИФ, так и ИФА (антигены и антитела (IgG)).
Streptococcus pneumoniae - самый частый возбудитель внебольничной пневмонии у лиц всех возрастных групп.
Пневмококк (вид Streptococcus pneumoniae) как представитель рода Streptococcus семейства Streptococcaceae имеет ряд характерных для других стрептококков свойств.
Пневмококк является грамположительным диплококком. oбычно ланцетовидным, имеющим полисахаридную капсулу, с размером клеток 1х0,2 мкм. Спор не образует, неподвижен.
S.pneumoniae является комменсалом верхних дыхательных путей. Вместе с тем пневмококк относят к потенциально патогенным микроорганизмам, поскольку он является ведущим этиологическим агентом острых внегоспитальных пневмоний, менингитов, средних отитов и синуситов; может вызывать также первичный сепсис, инфекции другой локализации.
Пневмококк растет при температуре 25-41 °С, оптимум - 37°С. Факультативный анаэроб со сложными пищевыми потребностями, однако 10-20% штаммов требуют анаэробных условий при первичной изоляции, особенно из крови. Пневмококк не имеет каталазы, ферментирует глюкозу по гексозомонофосфатному пути с образованием молочной кислоты. Для полноценного роста пневмококку необходимы высокомолекулярные пептоны, комплекс витаминов, пурины, пиримидины, холин. Все это обеспечивают сердечно-мозговые питательные среды, которые являются наилучшими для культивирования. Оптимум рН среды составляет 7,8. Нуждается в экзогенной каталазе, поэтому обязательным компонентом среды должна быть кровь, которая обогащает среду питательными веществами, обеспечивает буферное действие, поддерживает соответствующий кислородный баланс, а железо гемоглобина действует, как каталаза. Стимулируют рост низкая концентрация глюкозы (не более 0,1%), повышенное парциальное давление СО, (5-10%i).
На плотных питательных средах пневмококк образует небольшие, диаметром 1-2 мм, колонии с α-гемолизом, часто сходные со стрептококковыми (приподнятый край и центр - "блюдце"), но более прозрачные и влажные. Мукоидные колонии образуют 3-й и 37-й серотипы. Атипичные штаммы растут в виде шероховатых колоний (R-форма). В анаэробных условиях вокруг колоний некоторых штаммов может наблюдаться а-гемолиз. При росте на жидких питательных средах пневмококк образует диффузное помутнение.
Биохимическая активность характеризуется ферментацией ряда сахаров с образованием молочной кислоты: медленно ферментируются спирты и пентозы. Отличительным свойством S.pneumoniae является ферментация инулина.
В антигенном отношении пневмококк неоднороден. Известно 4 типа пневмококковых антигенов: капсульный полисахаридный антиген, С-полисахаридный антиген. М- и R-протенновые антигены. Капсульный полисахарид является типоспецифическим антигеном. Он обладает антифагоцитарной активностью (фактор вирулентности) и обусловливает выработку протективных антител. На основании различий в капсульных антигенах пневмококки разделены на 84 сероварианта. Определение капсульного антигена используется в диагностических целях и при создании вакцин. Атипичные штаммы не продуцируют капсульный полисахарид. С-полисахарид входит в состав клеточной стенки и обусловливает видоспецифнчность клеток (общий для всех пневмококков). М-протеиновый антиген - это типоспецифический белок, аналогичный М-белку стрептококков, однако он не имеет антифагоцитарных свойств. R-протеиновый антиген был выделен из шероховатых штаммов пневмококка.
Для исследования на пневмококки используются кровь, ликвор, плевральная и перикардиальная жидкости, пурулентная мокрота, биопсийный, бронхоскопический и другой клинический материал в зависимости от локализации очага инфекции. При выявлении бактерионосителей исследуют фарингеальные мазки. В случае предполагаемой задержки до обработки и исследования материал следует хранить при 4°С.
Наиболее ценным и в то же время простым экспрессным методом диагностики является реакция набухания капсулы по Найфельду. Для постановки теста готовят мазок из исследуемого материала с добавлением капли поливалентной пневмококковой антикапсульной сыворотки (омни-сыворотка) и капли метиленовой сини, после чего накрывают покровным стеклом и микроскопируют. В положительных случаях наблюдается guellung-эффект; капсула вокруг клеток пневмококка значительно увеличивается в размерах и становится четко видимой. Этот феномен позволяет легко выявлять и дифференцировать пневмококки от других стрептококков.
Идентификацию пневмококка после культивирования на питательных средах осуществляют по совокупности морфологических, физиологических, культуральных, серологических и биохимических свойств. Для дифференциации пневмококка от других видов зеленящих стрептококков используют два основных теста - лизис желчью или дезоксихолатами и чувствительность к оптохину (этилгидрокупреина гидрохлориду).
Тест лизиса желчью. Основан на способности 10% р-ра желчи крупного рогатого скота и 2% р-ра дезоксихолата или таурохолата натрия лизировать молодую культуру пневмококка. Желчь понижает поверхностное натяжение между бактериальной мембраной и средой, что ведет к ускорению естественного аутолитического процесса. Постановку теста осуществляют либо в жидкой среде, когда в две пробирки, одна из которых опытная, содержащая 10% желчный бульон, другая - контрольная с сывороточным бульоном, вносится испытуемая бульонная культура и выдерживается до часа, либо на плотной среде путем нанесения на газонный рост или изолированные колонии капли желчного бульона (дезоксихолата) и выдерживания, пока не высохнет капля (5-10 мин).
При лизисе пневмококка на жидкой среде отмечается просветление в опытной пробирке; на плотной среде на месте капли рост уплотняется или исчезает совсем. Рост стрептококков остается интактным.
Оптохиновый тест. Тест основан на различной чувствительности пневмококка и зеленящих стрептококков к оптохину. Рост пневмококка ингибируется концентрациями оптохина не более 5 мкг/мл При применении бумажных дисков, импрегнированных оптохином. которые накладывают на инокулированные штрихом чашки с кровяным агаром, зона ингибнрования роста S.pneumoniae после 18-часовой инкубации, значительно превышает зону -стрептококков.
Серотипирование пневмококков. Антигенную структуру пневмокков изучают в реакции агглютинации на стекле или в реакции Найфельда с использованием набора сывороток к капсульным полисахаридам. Набор состоит из ”omni”-сыворотки (антитела ко всем 84 сероварам), поливалентных пуловых сывороток, содержащих антитела к 4-7 сероварам и серогруппам, имеющим буквенное обозначение (от "А"до I"), и типовых сывороток, входящих в пулы. Идентификация может быть также осуществлена с использованием коммерческих реагентов для реакции коагглютинацни.