Химизм процесса брожения

В процессе брожения в условиях анаэробиоза в центре находится проблема выработки энергии при расщеплении углеводов. Основным механизмом является гликолитический путь распада (Эмбдена – Мейергоффа – Парнаса, гексозо-дифосфатный путь). Этот путь наиболее распространен, существую 2 гликолитических пути, которые встречаются в меньшей степени: окислительный пентозо-фосфатный путь (Варбурга – Диккенса – Хорекера), путь Энтнера – Дударова (КДФГ-путь).

Следует обратить вимание, что все эти механизмы нельзя рассматривать как брожение, так как они лежат в основе дыхания. Брожение начинается тогда, когда происходит утилизация оторвавшегося от субстрата протона или электрона и присоединения на акцептор.

ГЛИКОЛИЗ

Глюкоза под действием гексаминазы фосфорилируется в положении 6 – превращается в глюкозо-6-фосфат – метаболически более активную форму глюкозы. Донором фосфата выступает молекула АТФ.Глюкоза-6-фосфат изомеризуется в фруктозо-6-фосфат. Реакция обратима, уровень присутствия 2 веществ в зоне реакции одинаков.Фруктоза-6-фосфат присоединяет фосфатную группу к первому атому С и превращается в фруктоза-1,6-дифосфат. Реакции идёт с затратой энергии АТФ и катализируется фруктозо-1,6-дифосфат альдолазой (основной регуляторный фермент гликолиза).

Фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется на 2 фосфотриозы триозофосфатизомеразой. В результате образуются 2 триозы:фосфодиоксиацетон и 3-фосглицеральдегид (3-ФГА). Эти 2 триозы могут изомеризоваться одна в другую и проходить трансформацию до пирувата по одинаковому механизму. Это восстановительный этап (идёт с выработкой энергии).

Гликолиз

1. Гексокиназа

2. Глюкозо-6-фосфатизомераза

3. 6-Фосфофруктокиназа

4. Альдолаза

5. Триозофосфатизомераза

6. Гліцеральдегидфосфатдегидрогеназа

7. Фосфоглицераткиназа

8. Фосфоглицеромутаза

9. Енолаза

10. Пируваткиназа

Произошло образование 3-ФГК. Теперь можно подвести некоторые итоги. Клетка на этом этапе "вернула" свои энергетические затраты: 2 молекулы АТФ были затрачены и 2 молекулы АТФ синтезировались на 1 молекулу глюкозы. На этом же этапе в реакции окисления 3-ФГА до 1,3-ФГК и образования АТФ имеет место первое субстратное фосфорилирование. Энергия освобождается и запасается в макроэргических фосфатных связях АТФ в процессе перестройки сбраживаемого субстрата при участии ферментов. Первое субстратное фосфорилирование носит еще название фосфорилирования на уровне 3-ФГА. После образования 3-ФГК фосфатная группа из третьего положения переносится во второе. Далее происходит отщепление молекулы воды от второго и третьего атомов углерода 2-ФГК, катализируемое ферментом энолазой, и образуется фосфоенолпировиноградная кислота. В результате происшедшей дегидратации молекулы 2-ФГК степень окисления ее второго углеродного атома увеличивается, а третьего — уменьшается. Дегидратация молекулы 2-ФГК, приводящая к образованию ФЕП, сопровождается перераспределением энергии внутри молекулы, в результате чего фосфатная связь у второго углеродного атома из низкоэнергетической в молекуле 2-ФГК превращается в высокоэнергетическую в молекуле ФЕП. Молекула ФЕП становится донором богатой энергией фосфатной группы, которая переносится на АДФ с помощью фермента пируваткиназы. Таким образом, в процессе превращения 2-ФГК в пировиноградную кислоту имеет место высвобождение энергии и запасание ее в молекуле АТФ. Это второе субстратное фосфорилирование. В результате внутримолекулярного окислительно-восстановительного процесса одна молекула и донирует и акцептирует электроны. В процессе второго субстратного фосфорилирования образуется еще молекула АТФ; в итоге общий энергетический выигрыш процесса составляет 2 молекулы АТФ на 1 молекулу глюкозы. Такова энергетическая сторона процесса гомоферментативного молочнокислого брожения. Энергетический баланс процесса : С₆+2АТФ=2С₃+4 АТФ+2НАДФ∙Н₂

ГОМОФЕРМЕНТАТИВНОЕ МОЛОЧНО-КИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

Осуществляется молочно-кислым бактериями. Которые расщепляют углеводы по гликолитическому пути с последним образованием из пирувата молочной кислоты. У ГФМК- бактерий проблема донорно-акцепторой связи решается самым простым путём – этот вид брожения рассматривают как эволюционно самый древний механизм.

В процессе брожения пировиноградная кислота восстанавливается Н⁺ оторвавшимся от глюкозы. На пируват сбрасывается Н₂ с НАДФ∙Н₂. В результате чего образуется молочная кислота. Энергетический выход составляет 2 молекулы АТФ.

Молочно-кислое брожение осуществляют бактерии рода: Streptococcus, Lactobacillus,Leuconostoc.Все они Г⁺ ( являются палочками или кокками) неспорообразующие (Sporolactobacillus образуют споры). По отношению к кислороду молочно-кислые бактерии относятся к аэротолерантным, являются строгими анаэробами, но способны существовать в атмосфере кислорода. Они имеют ряд ферментов, которые нейтрализуют токсическое действие кислорода (флавиновые ферменты, негемовая каталаза, супероксиддисмутаза). МКБ не могут осуществлять дыхание, так как нет дыхательной цепи. В связи с тем, что природа обитания МКБ богата на факторы роста, в процессе эволюции они стали метаболическими инвалидами и утратили способность синтезировать в достаточном количестве факторы роста, поэтому в процессе культивирования они

Гомоферментативное молочнокислое брожение: Ф1 — гексокиназа; Ф2 — глюкозофосфатизомераза; Ф3 — фофсофруктокиназа; Ф4 — фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза; Ф5 — триозофосфатизомераза; Ф6 — 3-ФГА-дегидрогеназа; Ф7 — фофсоглицерокиназа; Ф8 — фосфоглицеромутаза; Ф9 — енолаза; Ф10 — пируваткиназа; Ф11 — лактатдегиброгеназа (по Dagley, Nicholson, 1973)

нуждаются в добавлении витамиов, аминокислот (овощные, растительные экстракты).

МКБ могут использовать лактозу, которая под действием β-галактозидазы в присутствии молекул воды расщепляется на D-глюкозц и D-галактозу. Впоследствии D-галактоза фосфорилируется и трансформируется в глюкозо-6-фосфат.

МКБ – мезофиллы с оптимальной температурой культивирования 37 - 40ºС. При 15ºС большинство из них не растут.

Способность к антагонизму связана с тем, что в процессе метаболизма накапливается молочная кислота и другие продукты, которые угнетают рост других микроорганизмов. Кроме того накопление молочной кислоты в культуральной жидкости приводит к резкому снижению рН, что угнетает рост гнилостных микрооргаизмов, а сами МКБ могут выдерживать рН до 2.

МКБ нечувствительны к многим антибиотикам. Это позволило использовать их в качестве продуцентов пробиотических препаратов, которые могут использоваться как препараты , сопровождающие при антибиотико-терапии (способствуют восстановлению микрофлоры кишечника, угнетаемой антибиотиками).

Экология МКБ. В природе встречаются там, где много углеводов: молоко, поверхность растений, пищевой тракт человека и животных. Патогенных форм нет.

СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ

В основе лежит гликолитический путь. В спиртовом брожении происходит усложнение решения донорно-акцепторной связи. Сначала пируват с помощью пируватдекарбоксилазы, ключевого фермента спиртового брожения, декарбоксилируется до ацетальдегида и CO₂:

CH₃-CO-COOH ® CH₃-COH + CO₂ .

Особенность реакции заключается в ее полной необратимости. Образовавшийся ацетальдегид восстанавливается до этанола с участием НАД⁺-зависимой алкогольдегидрогеназы:

CH₃-COH + НАД-H₂ ® CH₃-CH₂OH + НАД⁺

Донором водорода служат 3-ФГА (как и в случае молочнокислого брожения).

Процесс спиртового брожения суммарно можно выразить следующим уравнением:

C₆H₁₂O₆ + 2Ф_Н + 2АДФ ® 2CH₃-CH₂OH + 2CO₂ + 2АТФ +2H₂O.

Спиртовое брожение широко распространенный процесс получения энергии как у Про-, так и у Эукариотов. У Прокариотов встречается как у Г⁺ так и у Г^-. Промышленное значение имеет микроорганизм Zymomonas mobilies ( пульке из сока агавы), но в основе брожения лежит не гликолиз, а путь Энтнера – Дудорова или КДФГ-путь.

Основные продуценты спирта – дрожжи (пивоварение, виноделие, ферментные препараты, витамины группы В, нуклеиновые кислоты, белково-витаминные концентраты, пробиотические препараты).

ПРОПИОНОВОЕ БРОЖЕНИЕ

В пропионовокислом брожении мы имеем дело с реализацией третьей возможности превращения пирувата — его карбоксилированием, приводящим к возникновению нового акцептора водорода — ЩУК. Восстановление пировиноградной кислоты в пропионовую у пропионовокислых бактерий протекает следующим образом . Пировиноградная кислота карбоксилируется в реакции, катализируемой биотинзависимым ферментом, у которого биотин выполняет функцию переносчика CO₂. Донором CO₂-группы служит метилмалонил-КоА. В результате реакции транскарбоксилирования образуются ЩУК и пропионил-КоА. ЩУК в результате трех ферментативных этапов (аналогичных реакциям 6, 7, 8 цикла трикарбоновых кислот, превращается в янтарную кислоту.

Следующая реакция заключается в переносе КоА-группы с пропионил-КоА на янтарную кислоту (сукцинат), в результате чего образуется сукцинил-КоА и пропионовая кислота.

Образовавшаяся пропионовая кислота выводится из процесса и накапливается вне клетки. Сукцинил-КоА превращается в метилмалонил-КоА.

В состав кофермента метилмалонил-КоА-мутазы входит витамин B₁₂.

Превращение пировиноградной кислоты в пропионовую при пропионовокислом брожении: Ф1 — метилмалонил-КоА-карбоксилтрансфераза; Ф2 — малатдегидрогеназа; Ф3 — фумараза: Ф4 — фумаратредуктаза; Ф5 — КоА-трансфераза; Ф6 — метилмалонил-КоА-мутаза (по Daglev, Nicholson. 1973; Rose. 1971)

Энергетический баланс на 1 молекулу глюкозы образуется 2 молекулы пропионовой кислоты и 4 молекулы АТФ.

Бактерии р.Propionibacterium – это Г⁺ палочки, неспорообразующие, неподвижные, размножаются бинарным делением, являются аэротолерантными микроорганизмами. У них есть механизм защиты от токсического действия кислорода, некоторые могут осуществлять дыхание.

Экология: встречаются в молоке, кишечнике жвачных животных. Промышленный интерес: продуценты В12 и пропионовой кислоты.

МАСЛЯНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

При маслянокислом брожении пируват декарбоксилируется и присоединяется к КоА – образуется ацетил-КоА. Далее происходит конденсация: 2 молекулы ацетил-КоА конденсируются с образованием С₄-соединения ацето-ацетил-КоА, который выступает акцептором продукции Н₂.

Пути превращения пирувата в маслянокислом брожении, осуществляемом Clostridium butyricum: Ф1 — пируват:ферредоксиноксидоредуктаза; Ф2 — ацетил-КоА-трансфераза (тиолаза); Ф3 — (3-оксибутирил-КоА-дегидрогеназа; Ф4 — кротоназа; Ф5 — бутирил-КоА-дегидрогеназа; Ф6 — КоА-трансфераза; Ф7 — фосфотрансацетилаза; Ф8 — ацетаткиназа; Ф9 — гидрогеназа; Фдок — окисленный; Фд-H2 — восстановленный ферредоксин; ФН — неорганический фосфат

Далее С₄ соединени проходя через ряд последовательных превращений образует масляную кислоту. Этот восстановительный путь не связан с образованием энергии и создан исключительно для утилизации восстановителя. Параллельно существует вторая окислительная ветвь, которая приводит к образоваию из пирувата уксусной кислоты и на этом участке имеет место субстратное фосфорилирование, что обуславливает синтез АТФ.

Энергетический баланс рассчитать сложно, поскольку направление реакций определяется внешними факторами, а также питательной средой:

1 мол. глюкозы→≈3,3 АТФ

Маслянокислое брожение осуществляют бактерии р.Clostridium – это Г⁺ палочки, подвижные, спорообразующие (эндоспоры d>d_кл), являются исключительно анаэробными культурами. Движение осуществляют за счет перетрихиально расположенных жгутиков. По мере старения клетки теряют жгутики и накапливают гранулёзу (крахмалоподобное вещество). По способности збраживать субстрат разделяются на 2 типа:

· сахаролитические (расщепляют сахара, полисахариды, крахмал, хитин);

· протеолитические (имеют мощный комплекс протеолитических ферментов, расщепляют белки).

Клостридии осуществляют не только масляно-кислое брожение, но и ацетонобутиловое. Продуктами этого вида брожения на ряду с масляной кислотой и ацетатом могут быть: этанол, ацетон, бутиловый спирт, изопропиловый спирт.

АЦЕТОНОБУТИЛОВОЕ БРОЖЕНИЕ

Образование нейтральных продуктов при ацетонобутиловом брожении: Ф1 — бутирилальдегиддегидрогеназа; Ф2 — бутанолдегидрогеназа; Ф3 — КоА-трансфераза; Ф4 — ацетоацетатдекарбоксилаза; Ф5 — изопропанолдегидрогеназа; Ф6 — ацетальдегиддегидрогеназа; Ф7 — алкогольдегидрогеназа

При ацетонобутиловом брожении продуценты в молодом возрасте (логарифмическая фаза роста) осуществляют брожение по типу маслянокислого. По мере снижения рН и накопления кислых продуктов индуцируется синтез ферментов, приводит к накоплению нейтральных продуктов (ацетон, изопропиловый, бутиловый, этиловый спирты). Изучая процесс ацетонобутилового брожения русский ученый Шапошников показал, что оно проходит 2 фазы и в основе 2^х фазности процесса лежит связь между конструктивным и энергетическим метаболизмом. Первая фаза характеризуется активным ростом культуры и интенсивным конструктивным метаболизмом, по этому в этот период происходит отток восстановителя НАД∙Н₂ на биосинтетические нужды. При затухании роста культуры и переходе ее во вторую фазу уменьшается потребность в конструктивных процессах, что приводит к образоваию более восстановлеых форм – спиртов.

Практическое применение Clostridium:

· производство масляной кислоты;

· производство ацетона;

· производство бутанола.

Бактерии играют огромную роль в природе: осуществляют гниение, анаэробное гниение клетчатки и хитина (некоторые расщепляют пектиновые волокна). Среди Clostridium имеются патогенны (возбудители ботулизма – выделяют крайне опасный экзотоксин; возбудители газовой гангрены; столбняка).

Альтеративные механизмы сбраживаия углеводов

ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ ПУТЬ

В 40^х годах был расшифрован окислительный пентозофосфатный путь, который показал, каким образом в микробной клетке синтезируются пентозы и как эти пентозы используются в качестве энергетического субстрата.

Первая реакция заключается в фосфорилировании глюкозы с помощью АТФ и превращении ее в метаболически активную форму глюкозо-6-фосфата, аналогично тому, что имеет место на первом этапе гликолиза. Следующий этап заключается в дегидрировании глюкозо-6-фосфата, катализируемом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой. Особенность реакции в том, что в ней участвует НАДФ⁺ в качестве акцептора водорода. Образовавшийся продукт реакции очень нестоек и спонтанно или с помощью фермента лактоназы гидролизуется с образованием 6-фосфоглюконовой кислоты, которая подвергается окислительному декарбоксилированию, катализируемому фосфоглюконатдегидрогеназой. Эта реакция приводит к образованию соответствующего пентозофосфата, НАДФ-H₂ и выделению CO₂. Рибулозо-5-фосфат обратимо превращается в ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат с участием ферментов фосфопентозоэпимеразы и фосфопентозоизомеразы соответственно.

Суммарно весь процесс можно представить в виде следующего уравнения:

глюкозо-6-фосфат + 2НАДФ⁺ ® рибозо-5-фосфат + CO₂ + 2НАДФ-Н₂.

Биологический смысл механизма – образование пентоз как для конструктивного метаболизма, так и для энергетического.

Окислительный пентозофосфатный путь (начальные этапы): Ф1 — гексокиназа; Ф2 — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; Ф3 — лактоназа; Ф4 — фосфоглюконатдегидрогеназа (декарбоксилирующая); Ф5 — фосфопентозоэпимераза; Ф6 — фосфопентозоизомераза (по Dagley, Nicholson, 1973)

ГЕТЕРОФЕРМЕНТАТИВНОЕ МОЛОЧНО-КИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

(ГФМК)

Строгие ГФМКБ могут утилизировать гексозы по окислительному пентозофосфатному пути. У них отсутствует механизм гликолиза, поскольку у них нет фермента альдолазы, расщепление гексозы на 2 фосфотриозы и нет изомеразы, которая изомеризует 2 триозы одну в другую. Конечными продуктами являются: молочная кислота, уксусная кислота, этиловый спирт.

Подавляющее большинство МКБ являются факультативными в плане образования молочной кислоты (гликолитические и пентозофосфатные механизмы).

Механизм ГФМК брожения.

При ГФМК брожении ксилулоза-5-фосфат кетолазой расщепляется на 2 соединения (С₃ - 3фосфоглицеральдегид и С₂ – ацетилфосфат). С₃-соединение метаболизируется до молочной кислоты через пируват в реакциях аналогичных гликолизу (на этом этапе выделяется 2 молекулы АТФ в реакциях субстратного фосфорилирования). С₂ –соединение метаболизируется в двух направлениях:

· восстановительная ветвь (утилизация НАД∙Н₂ ) в результате получается этанол;

· окислительная ветвь (приводит к образоваию уксусной кислоты и 1 молекулы АТФ).

Энергетический баланс брожения: При расщеплении С₆-соединения в процессе окисления пентозофосфатного пути с дальнейшим метаболизмом пентозы по пути ГФМК брожения приводит к образованию молочной кислоты и этанола, либо молочной и уксусной кислоты. При этом если образуется молочная кислота и этанол выделяется 1 молекула АТФ. При образовании уксусной и молочной кислот выделяется 2 молекулы АТФ. Соотношение продуктов в ходе этого процесса будет определяться видом организма, составом питательной среды, условиями культивирования и возрастом культуры.

Гетероферментативное молочнокислое брожение: Ф1 — пентозофосфокетолаза; Ф2 — 3-ФГА-дегидрогеназа; Ф3 — фосфоглицераткиназа; Ф4 — фосфоглицеромутаза; Ф5 — енолаза; Ф6 — пируваткиназа; Ф7 — лактатдегидрогеназа; Ф8 — ацетальдегиддегидрогеназа; Ф9 — алкогольдегидрогеназа; Ф10 — ацетаткиназа (по Schlegel, 1972)

ПУТЬ ЭНТНЕРА – ДУДОРОВА ИЛИ КДФГ – ПУТЬ

Первые два его этапа — фосфорилирование молекулы глюкозы и ее дегидрирование до 6-фосфоглюконовой кислоты — идентичны первым двум этапам окислительного пентозофосфатного пути. Специфичны для пути Энтнера — Дудорова две следующие реакции: 1) дегидратирование 6-фосфоглюконовой кислоты, приводящее к образованию КДФГ-кислоты; 2) расщепление продукта первой реакции на два C₃-фрагмента. Конечными продуктами второй реакции являются пировиноградная кислота и 3-ФГА. Последний окисляется в пировиноградную кислоту так же, как в гликолитическом пути. Следовательно, при разложении молекулы глюкозы до пирувата по пути Энтнера — Дудорова образуется 1 молекула АТФ (2 молекулы АТФ синтезируются на отрезке пути 3-ФГА пировиноградная кислота минус 1 молекула АТФ, затраченная на фосфорилирование глюкозы), 1 молекула НАД-H₂ и 1 молекула НАДФ-H₂.

Биологический смысл этого механизма состоит в образовании пирувата более коротким путём в тот период, когда молодая культура расходует пируват в биосинтетических процессах при синтезе аминокислот. Путь Энтнера – Дудорова имеет важное значение, когда збраживаемым субстратом является глюконовая, манановая, гексауроновая кислоты и их производные. Этот механизм известен у многих микроорганизмов (больше свойственен Г^-). Он лежит в основе спиртового брожения у микроорганизмов Zymomonas mobilis.