ТЕМА: Виды стерилизации. Приготовление питательных сред.
Вопросы для рассмотрения
1. Оборудование, используемое в микробиологии для стерилизации.
2. Питательные среды и их ингредиенты.
3. Виды стерилизации.
4. Подготовка посуды к микробиологическому анализу.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Приготовить питательную среду (МПА)
2. Подготовить посуду к стерилизации
3. Стерилизация среды в автоклаве
Микроорганизмам для роста, развития и размножения необходимы все входящие в состав микробной клетки элементы. Они также должны быть обеспечены энергией. Синтетические способности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны. В связи с этим различны и требования микроорганизмов к источникам питания.
Разнообразие обмена веществ у микроорганизмов связано, в большинстве случаев, с их отношением к источникам углерода и азота, обычно эти соединения определяют специфичность питательных сред. Для одного и того же микроорганизма могут быть использованы разные среды. Это зависит от задач исследования. Особые среды нужны для образования спор. Для получения определенных продуктов обмена необходимы специальные среды, отличны от тех, в которых микроорганизмы культивируются длительное время.
По составу питательные среды подразделяют на две группы: натуральные (естественные) и синтетические. Натуральными называют среды, имеющие неопределенный химический состав, так как они состоят из продуктов растительного или животного происхождения, используемых в виде настоев или экстрактов (овощи, фрукты, их отвары, солод, дрожжи, части растений, молоко, мясо, животные ткани, куриное яйцо). В таких средах трудно учесть потребление микроорганизмами отдельных веществ – продуктов обмена микробных клеток. Поэтому натуральные среды малопригодны для изучения физиологии микроорганизмов.
В синтетические среды входят в точно указанных концентрациях только известные химически чистые соединения. Синтетические среды могут быть простыми по составу или иметь относительно большой набор компонентов. Их широко используют для изучения обмена веществ микроорганизмов.
Существуют и так называемые “полусинтетические” среды, относящиеся к средам с неопределенным составом, они содержат соединениями известной химической природы, наряду с веществами неопределенного состава. Примером полусинтетических сред являются следующие: мясопептонная среда, в которую наряду со сложными и неопределенными по химическому составу веществами (мясной бульон) иногда входят пептон, глюкоза или сахароза, поваренная соль, фосфорнокислый калий; картофельные среды с глюкозой и пептоном. Полусинтетические среды широко используются в промышленной микробиологии для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, плотные и сыпучие.
Жидкие средыиспользуют для накопления биомассы или продуктов обмена при выяснении физиолого – биохимических особенностей микроорганизмов
Плотные средыготовят из жидких, добавляя 1,5-2,5% агар-агара или 10-15% желатины.
Агар-агар – растительный коллоид, состоящий главным образом из полисахаридов с низким содержанием азотистых веществ.
Желатина– кислый азотсодержащий продукт, добываемый путем выварки костей и хрящей.
Основой плотной среды может служить кремнекислый гель, введенный в микробиологическую практику С.Н. Виноградским.
Сыпучие среды– разваренное пшено, отруби, пропитанные питательным раствором, - используют в промышленной микробиологии.
С.Н. Виноградским и М. Бейеринком введены в микробиологическую практику элективные (или избирательные) среды. Эти среды создают условия для преимущественного развития одного вида или группы родственных микроорганизмов и мало пригодны или совсем непригодны для развития других
Методы стерилизации
Приготовленные среды, как правило, стерилизуют (Sterilis - бесплодный). Методы стерилизации (обеспложивания) основаны на двух принципах:
а) уничтожение клеток микроорганизмов и их спор в питательных средах, на посуде, инструментах и других предметах – методы термической и лучевой (холодной) стерилизации;
б) отделение клеток микроорганизмов – метод фильтрования (холодная стерилизация).
I. Холодная стерилизация:
1) Фильтрование;
2) стерилизация ультрафиолетовыми лучами;
3) химическая стерилизация и дезинфекция.
II. Термическая стерилизация:
1) прокаливание на пламени (фламбирование);
2) стерилизация сухим жаром;
4) стерилизация текучим паром – тиндализация;
5) пастеризация;
6)стерилизация насыщенным паром под давлением – автоклавирование.
Приготовление мясопептонного агара (МПА).
Наиболее распространенной средой, на которой растет большинство микроорганизмов, использующих органические формы азота, является МПА.
Для приготовления 1 л среды необходимо сделать следующее:
1) в термостойкую колбу на 1500-2000 мл положить 2 мясных кубика, высыпать 5 г глюкоза (0,5%), 5 г сахара (0,5%), 10г пептона (1%);
2) добавить 1000 мл дистиллированной воды;
3) колбу с ингредиентами поставить на водяную баню для расплавления агар – агара, которого добавляем 20г (2%); (температура плавления агара 1000С, застывания - 400С);
4) установить слабо щелочную реакцию среды (большинство микроорганизмов развивается лучше на средах с рН 7,0-7,2), для чего использовать 20%-й раствор Na2Co3; реакцию среды проверить лакмусовой бумажкой, смоченной дистиллированной водой. Более удобно использовать индикатор бромтимолблау, имеющей в нейтральной среде бутылочно-синий, в кислой – желтый цвет. 1-2 капли индикатора внести в фарфорную чашечку и стеклянной палочкой добавить 1-2 капли расплавленного МПА;
5) разлить среду по пробиркам и колбам, закрыть ватными пробками, завернуть плотной бумагой. Посуду со средой поместить в автоклав и стерилизовать 30 мин при давление в 1атм. После стерилизации пробирки с еще не застывшей средой раскладывают на ровной поверхности стола в наклонном (под небольшим углом) положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки, косые или скошенные среды.Плотная среда, застывая при вертикальном положении пробирки, называется столбиком.
Контрольные вопросы
1. Подразделение питательных сред по: а) составу; б) назначению; в) физическому состоянию.
2. Термическая стерилизация:
способы и характеристика.
3. Холодная стерилизация:
способы и характеристика.
4. Подготовка сред к стерилизации и их стерилизация.
5. Подготовка посуды к стерилизации. Какими способами ее стерилизуют?
Рекомендованный материал
1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под редакцией Егорова Н.С. МГУ, М. 1995г Стр. 29-55, 202-208.
4. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М. !972. Стр.56-68.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец.литература», С-Петербург. 1998. Стр. 78-79
ЗАНЯТИЕ 7