Проведение гомогенного ИФА мочи.

Используют следующий набор диагностикума: Реагенты:

1. Реакционная виала, содержащая:

• антитело на фенобарбитал

• кофермент НАД

• конъюгат (фенобарбитал, меченный глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой)

• хромогенное вещество

• буфер

• консервант

2. Негативный контроль (холостой образец – моча человека, в которой заведомо нет фенобарбитала, с консервантом – азидом натрия)

3. Позитивный контроль. Контрольный образец, содержащий 1 мкг/мл фенобарбитала, лиофилизированную мочу человека и азид натрия

4. Калибратор. Контрольный образец, содержащий фенобарбитал в концентрации 0,5 мкг/мл.

Проведение анализа.

1 Отбор и хранение биообразцов. Образцы мочи отбирают в пластиковые или стеклянные контейнеры.

2. Анализ.

• приготовление калибратора и контролей

• контроль температуры – 22 – 25С

• включение спектрофотометра

• мочу помещают в виалу, виалу – в держатель и проводят СФ.

3. Интерпретация результатов

1. Цветные реакции

· + изопропиламин и соли Co (р-в Пари) -> фиолетовое

· + соли Co и щелочь -> розовое

· + мурексидная проба -> розовое

· + родамин -> оранжевое (слой в хлороформе)

· + пиридин и соли Cu -> аморфный осадок

2. УФ – спектроскопия

Вытяжка из биоматериала -> упаривание -> сухой остаток + вода

· + NH4OH -> спектр при 240нм (фенобарбитал, барбитал)

· + H2SO4 -> спектр не должно быть максимума

290нм – для тиобарбитуратов

· + NaOH -> спектр при 240нм (фенобарбитал, барбитал)

305нм – для тиобарбитуратов

Количественное определение

ГЖХ-анализ

Условия газохроматографического анализаГазовый хроматограф с термоаэрозольным детектором (ТАД) или с беспламенным азотно-фосфорным детектором (NPD). Колонка стеклянная, силанизированная, длиной 1 м, внутренний диаметр 2 - 3 мм. Сорбент - 3%-ный SE-30 на хромосорбе W (HP)- 80 - 100 меш. Скорость газа-носителя - 45 мл/ мин азота для ТАД и 40 мл/мин гелия для NPD.

Температура детектора 300ºС. Температура испарителя 250ºС. Температура термостата колонки изменяется по линейной программе от 130 до 290ºС со скоростью 20ºС в минуту. Выдерживание при конечной температуре занимает до 15 минут общего анализа. Объем вводимой пробы - 2,5 мкл.

Подготовка пробы:

0,2 мл плазмы/мочи + 1,3 мл воды и ацетатного буфера + смесь этилацетат/диэтиловый эфир à встряхивание 5 минут à центрифугирование à отделение органики à упаривание + ТМАГ à метилирование барбитуратов

ВЭЖХ -анализ

Условия хроматографирования:

• хроматограф жидкостный

• хроматографическая колонка (6282 мм), заполненная обращено-фазным сорбентом Сепарон

• подвижная фаза - элюент - смесь 0,05М водного раствора двузамещенного фосфата аммония и метанола (60:40)

• скорость потока элюирования - 100 мкл/мин

• детектирование - при длине волны 240 нм.

Подготовка пробы: кровь/моча + стандарт + вода + ацетатный буфер à перемешивание à центрифугирование à упаривание органики à анализ

Приготовление стандартных образцов.

Для приготовления эталонных растворов используется чистые субстанции барбитала, фенофарфитала, циклобарбитала, барбамила и этаминала натрия. Эти растворы служат для идентификации указанных веществ, определения их хроматографических параметров, а также для приготовления контрольных растворов при проведении количественных анализов.

Градуировка хроматографа проводится по фенобарбиталу, барбамилу и этаминалу натрия.

Качественный анализ.

Идентификация проводится следующим образом:

• сопоставляют время удерживания и коэффициент емкости определяемого компонента и образца сравнения - фенобарбитала;

• сравнивают УФ-спектры предполагаемого компонента и образца сравнения;

• оценивают совпадение значений времени удерживания определяемого
компонента и образца сравнения при добавлении контрольного раствора в
раствор экстракта из биопробы (причем концентрация образца сравнения
должна быть близка к концентрации определяемого компонента);

• сопоставляют УФ-спектры определяемого компонента и образца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.

Концентрация определяемого вещества (Ci) в растворе экстракта из биопробы определяется по формуле

где

C_k - концентрация "добавки" в растворе подвижной фазы;

V_k - объем добавленного контрольного раствора;

Vi- объем раствора экстракта с определяемым веществом;

hi - высота сигнала определяемого вещества в растворе экстракта из биопробы;

hi+k - высота сиrnала определяемого вещества после добавки в раствор экстракта

контрольного раствора.

Метод внешнего стандарта

В соответствии с методом внешнего стандарта и с учетом линейности зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, с анализом раствора экстракта биопробы, проводят анализ контрольного раствора идентифицированного вещества. концентрация контрольного раствора (Ck) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализы контрольного раствора и экстракта биопробы должны проводитьсяв одном масштабе регистрации. Концентрация определяемого вещества в растворе экстракта (Ci) рассчитывается по формуле

Ci = Ck*hi/Hk, где Ck - концентрация контрольного раствора;

hi- высота сигнала определяемого наркотического вещества в

растворе экстракта биопробы; hk - высота пика вещества контрольного раствора.

Метод внутреннего стандарта

В соответствии с методом внутреннего стандарта в биообьект до операции пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт. В анализе барбитуратов в количестве внутренних стандартов рекомендуется использовать одно изследующих веществ: апробарбитал, метилфенобарбитал, фенилubдантоин и другне вещества, которые в данных условиях xpoмaтoграфического разделения должны

полностью отделяться от других компонентов образца, должны элюироваться близко к пику анализируемого соединения, не реагировать с другими компонентами, т.е. удовлетворять требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту. Можно использовать одновременно два и более внутренних стандарта. Концентрация определяемогo вещесгва (CI) рассчитывается по формуле

Ci = Cbc * Hi /Hbc *1/Fi/bc, где Свс - концентрация внутреннего стандарта;

hi - высота пика (или площадь) определяемого вещества; h_вс - высота пика (или площадь) стандарта; Fi/вc - относительный калибровочный фактор.

Относительный калибровочный фактор компонента Fi/вc вычисляется по формуле

Fi/bc = Hi * Cbc/Ci * Hbc, где hl- высота пика (или площадь) компонента известной концентрации (калибровочный раствор); CI - концентрация калибровочного раствора определяемого компонента; h_вс - высота пика (или площадь) внутреннего стандарта;

Сbc - концентрация внутреннего стандарта

УФ-спектрофотометрия.

Спектрофотометрическое определение основано на способности фенобарбитала к лактим-лактамной (амидоимидольной) таутомерии. При pH=2,0 барбитурат находится в растворе в лактамной форме, не обладающей специфической абсорбцией в пределах 200-300 нм. При pH=10,0 образуется монолактимная форма, в гетероциклическом ядре возникает двойная связь, наблюдается поглощение при 240 нм. При pH=13 и выше в растворе присутствует дилактимная форма с двумя двойными связями в кольце. Абсорбция наблюдается при 255-260 нм.

Для определения рекомендованы методы прямого и дифференциального спектрофотометрирования.

Прямая СФМ: проводится при pH=10 и 240 нм.

Дифференциальные методы:

- при pH=2,0-10,0 и 239 нм - если исследуются внутренние органы трупа;

- при pH=10,0-13,0 и 260 нм - если исследуется кровь и моча. Дифференциальные методы дают более надежные результаты, т.к. исключают влияние посторонних веществ, экстрагируемых хлороформом из кислого раствора вместе с фенобарбиталом.

УФ-спектральные характеристики фенобарбитала: при pH = 9,2 наблюдается поглощение при 239 нм (ε_а = 452); при pH = 13,0 поглощение при 254 нм (ε_а = 342).

Для расчета содержания барбитурата пользуются калибровочным графиком или значениями показателя удельного поглощения.

В сочетании с хроматографией метод УФ-спектрофотометрии является достаточно специфичным, быстрым и чувствительным. Определяются микрограммовые количества фенобарбитала.

Фенобарбитал

Депрессант центральной нервной системы. Кристаллическое вещество с температурой плавления 245°. Вещество кислого характера, pK_a=7,3. Плохо растворимо в воде, хорошо растворимо в этаноле и в водных растворах щелочей. УФ-спектр имеет два максимума поглощения при щелочных значениях pH (при pH=9,2 λ_нм=239; при pH=13,0 λ_нм=254). ИК-спектр имеет следующие характеристические частоты: 1684, 1712, 1770, 1310.

Соединение быстро всасывается после орального введения, экскретируется в неизменном виде до 30%. Препарат пролонгированного действия (10-18 часов), период полувыведения 3 дня. Фенобарбитал используется как снотворное и противосудорожное средство. Фенобарбитал дает длительный сон, мало изменяется в организме и выводится в значительной степени почками в неизменном состоянии.

В относительно больших дозах фенобарбитал способен вызывать смертельное отравление. (0,6 – 1 г.). ВРД 0,2, ВСД 0,5.

В организме человека фенобарбитал подвергается, в основном, в печени ряду превращений:

1) Окислению одного из радикалов

2) Окислению до кислот и кетонов

3) Десульфированию

4) Демитилированию

5) Гидролизу

Метод Валова

100 г измельченного биологического материала + 180 мл воды и 20 мл 10 %-го раствора гидроксида натрияà 30 мин при частом перемешиванииà центрифугируют 30 минà надосадочная жидкость + 120 мл 10 %-го раствора вольфрамата натрия и 1 н. раствор серной кислоты (до рН=2)à нагревают на кипящей водяной бане 20 минà центрифугированиеà центрифугат процеживают через ватный тампонà собирают в делительную воронку + диэтиловый эфирàэфирный слой + 50 мл 10%-го гидроксида натрияà водный слой отделяют + 25 %-ным раствор серной кислоты до рН=2 + диэтиловый эфирà эфирная вытяжка

Подтверждающие исследования

Цветные реакции:

• с аммиачным раствором нитрата или ацетата кобальта. При наличии барбитуратов появляется розово-фиолетовое окрашивание.

• мурексидная проба. Через некоторое время по краям сухого остатка появляется розовое и красное окрашивание, которое становится интенсивней при смачивании остатка 25% раствором гидрата окиси аммония.

Микрокристаллоскопические реакции:

• перекристаллизация: на предметное стекло помещают сухой остаток. Через 24 часа наблюдают форму осадка – сферолиты, в виде «ежиков».

• с железоиодидным комплексом. Раствор хлорида окисного железа + концентрированная соляная кислота + калия иодид. Через 10 минут наблюдают образование сростков кристаллов.

Бензонал

Кристаллическое вещество с температурой плавления 137°. Вещество кислого характера, pK_a=7,3. Бензонал трудно растворяется в воде и этиловом спирте, легче — в диэтиловом эфире, хлороформе и диметилформамиде. Экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Бензонал в основном применяется для лечения судорожных форм эпилепсии. Иногда он применяется для лечения больных, страдающих припадками, не сопровождающимися судорогами. ВРД 0,3, ВСД 0,6.

Метаболитами бензонала являются бензойная кислота и фенобарбитал, который, в свою очередь, подвергается метаболизму. Бензонал и его метаболиты в основном выделяются с мочой.

Выделение бензонала из биологического материала.

100 г измельченного биологического материала + 10 мл р-ра соляной кислоты + 50 г сульфата аммонияà перемешивают + 200 мл смеси равных объемов этилового спирта и хлороформаà настаивают 2 ч при перемешиванииàвытяжку сливают и фильтруют через плотный бумажный фильтрà промывают смесью этилового спирта и хлороформа (1 : 1)à водную фазу, насыщенную сульфатом аммония, отделяют и не исследуют. Слой органических ра­створителей выпаривают досуха + 200 мл горячей воды àперемешивают и фильтруютà + три порции хлороформаàхлороформные вытяжки + фосфатный раствор (рН = 7,4) à хлороформный слой фильтруют через бумажный фильтрà хлороформную вытяжку используют для идентификации и коли­чественного определения бензонала. Поскольку бензонал частично разлагается в организме на фенобарбитал и бензойную кислоту, наличие последней опреде­ляют в водной фазе. С этой целью водную фазу подкисляют раствором соляной кислоты (1 : 1) до рН = 2 и взбал­тывают с 10 мл хлороформа. От водной фазы отделяют хлоро­формную вытяжку, которую исследуют на наличие бензойной кислоты.

Подтверждающие исследования

1. Бензонал с изопропиламином и солями кобальта дает фио­летовую окраску

2. С солями кобальта и щелочами бензонал дает сине-фиоле­товую окраску

3. Бензонал можно обнаружить по форме кристаллов, кото­рые образуются после прибавления к нему метилового спирта и концентрированной соляной кислоты. Через несколько минут в поле зрения под микроскопом появляются ромбической формы кри­сталлы или сростки из них.

4. Обнаружение методом хроматографии.

НФ: силикагель

ПФ: хлороформ:н-бутанол:25% раствор аммиака

Д: 0,02 %-м хлороформным раствором дифенилкарбазида, затем раствором сульфата ртути.

Пятна бензонала на пластинке имеют Rf =* 0,40...0,45. 10. При наличии барбамила пятна на хроматограмме приобретают сине-фиолетовую или красно-фиолетовую окраску.

Гексенал

Хорошо растворяется в воде, этиловом спирте и хлорофор­ме, слабо — в диэтиловом эфире. Гексенал экстрагируется орга­ническими растворителями из кислых водных растворов.

Гексенал проявляет сно­творное действие, а в больших дозах он имеет наркотические свойства. Его применяют для наркоза в сочетании с оксидом азота (I), фторотаиом и с некоторыми другими веществами. Гек­сенал и сам может применяться для кратковременного наркоза (продолжительностью 15—20 мин).

Гексенал относится к барбитуратам короткого периода действия. В организме он подвергается метаболизму не­сколькими путями:

· Гидроксилирование циклогексильной группы à окисление с образованием 3'-кетогексабарбитала à N-деметилирование.

· N-деметилирования при атоме азота в третьем положенииà норгексабарбитал.

· Определенное количество гексена­ла, поступившего в организм, метаболизируется путем разрыва цикла барбитуровой кислоты.

Подтверждающие исследования

1. От прибавления солей кобальта и изопропиламина к гексеналу появляется фиолетовая окраска.

2. Гексенал с солями кобальта и щелочью дает розовую или красную окраску.

3. От прибавления концентрированной серной кислоты к гексеналу образуется осадок, состоящий из сростков игольчатых кристаллов.

4. Гексенал с подкисленным спиртовым раствором иодида ка­лия образует кристаллический осадок.

5. Обнаружение гексенала по УФ-спектрам. Гексенал в ходе
химико-токсикологического анализа выделяется из биологического материала в виде гексобарбитала, который можно обнару­жить по спектрам поглощения

В ИК-области спектра гексенал (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1712, 1660, 1390, 1358 см^-1,

Тиопентал-натрий

Легко растворим в воде, практически нерастворим в бензоле и эфире. Средство для внутривенного наркоза.

Анализ см. «Общая информация»