Количественные методы учета микроорганизмов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МУРМАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВПО «МГТУ»)

Кафедра микробиологии и биохимии

Методические указания

к лабораторным работам

по дисциплине «Гидромикробиология»

для направления подготовки 06.03.01 Биология

Мурманск,

Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Гидромикробиология» рассмотрены и одобрены на заседании кафедры-разработчика Микробиология и биохимия

«_____» __________________ протокол № __________.

^дата

Составители – Ускова Инга Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии и биохимии; Блинова Екатерина Игоревна, старший преподаватель кафедры микробиологии и биохимии

Рецензент – Мирошниченко Екатерина Сергеевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник кафедры микробиологии и биохимии

Лабораторная работа 1

Количественные методы учета микроорганизмов

Важным микробиологическим показателем, характеризующим водные экосистемы, является общая численность бактерий, определяемая как по прямому счету, так и методами посева на питательных средах. Результаты определения численности бактерий в водных местообитаниях существенным образом зависят от методов, использованных для подсчета бактерий.

Методы учета общей численности бактерий в водных экосистемах по прямому счету

Общая численность бактерий (ОЧБ) в водных экосистемах является значительно более стабильным показателем, по сравнению с численностью гетеротрофных бактерий по посеву. Пределы колебаний этого показателя в одном и том же водоеме редко превышают один порядок величин, тогда как для численности евтрофных или олиготрофных бактерий размах колебаний обычно составляет несколько порядков.

Известно, что содержание бактерий в воде находится в тесной связи с трофическим типом водоёма. Преимущество микробиологической индикации степени трофии водоёмов по величинам ОЧБ состоит в относительной стабильности этого показателя в течение года. Поэтому о типе водоёма можно судить по пробам, отобранным в любой период времени.

При учете бактериальных клеток прямым микроскопическим методом достоверный подсчет их количества является одним из важнейших моментов. Завышение или занижение величин количественных характеристик бактериопланктона может привести к неадекватной оценке его структурной и функциональной роли в водоеме.

Для определения общей численности бактерий используют прямой микроскопический метод, при этом учет численности проводят либо методом световой микроскопии с окраской бактерий раствором карболового эритрозина, либо в люминесцентном освещении с окраской клеток акридиновым оранжевым.

Определение общей численности бактерий (ОЧБ) методом люминесцентной микроскопии

Для учета ОЧБ используют метод люминесцентной микроскопии с использованием красителя акридинового оранжевого.

Реактивы:спиртовой раствор Судана черного (перенасыщенный), спирт 70 %, формалин 40 %, профильтрованная дистиллированная вода, порошок акридинового оранжевого, нефлюоресцирующее масло.

Оборудование и посуда:люминесцентный микроскоп, фильтры, пробирки, пипетки.

Приготовление акридинового оранжевого:

- 0,2 г порошка АО растворить в 200 мл профильтрованной (через 0,45 мкм фильтр) дистиллированой водой (раствор 0,1 %).

- в готовый раствор АО добавить 12 мл 40 % формалина

- хранить готовый раствор в холодильнике.

Порядок выполнения работы:

1. Подготовить фильтровальную установку.

2. Профильтровать исходный раствор АО в необходимом количестве.

3. Пробы воды предварительно встряхивают в течение одной минуты, затем дают пробе отстояться в течение минуты для оседания крупной взвеси.

4. Отобрать 2 мл пробы и добавить 0,5 мл свежеприготовленного раствора АО.

5. Окрашивать 5 мин.

6. Смочить фильтр спиртом, высушить его.

7. Смочить фритту дистилированной водой и уложить фильтр, собрать фильтровальную установку.

8. В воронку влить окрашенную пробу, фильтровать под слабым вакуумом.

9. После фильтрации фильтр подсушивают на воздухе.

10. Затем на поверхность предметного стекла наносят маленькую каплю нефлюоресцирующего масла и помещают на нее мембранный фильтр. Сверху на фильтр также наносят каплю нефлюоресцирующегоо масла и накрывают его покровным стеклом. Пинцетом выдавить пузырьки воздуха, накапать нефлюоресцирующего масла.

11. Подсчет клеток проводят с помощью люминесцентного микроскопа МИКМЕД-1 со светоделительной пластиной «зеленая» с иммерсионным объективом (100х) и окуляром (15х) с сетчатым микрометром. Подсчет ведут не менее чем в 20 полях зрения.

Количество бактерий, содержащихся в 1 мл рассчитывают по формуле:

Количественные методы учета микроорганизмов - student2.ru ,

где X - количество бактерий в 1 мл;

е - площадь фильтра, мм²;

а - просчитываемая площадь, мкм²;

ж - объем профильтрованной пробы воды, мл;

г- число полей зрения, в которых считали клетки;

n - сумма подсчитанных бактерий в г полях зрения;

10⁶ - коэффициент для пересчета мм² в мкм².

Лабораторная работа 2

Методы определения численности бактерий в водных экосистемах, способных к росту на питательных средах

По способности к росту при различных концентрациях органических субстратов гетеротрофные микроорганизмы можно разделить на две группы, одна из которых обладает способностью к росту при очень низком содержании субстрата в среде - олиготрофные бактерий, а вторая - при высоком – евтрофные. При этом микроорганизмы второй группы не проявляют активности, но и не погибают при низких концентрациях органических субстратов в среде.

Для учета численности евтрофных и олиготрофных бактерий применяют различные по составу среды.

Для учета евтрофных бактерий используют среды, содержащие 2 и более граммов органического углерода в литре.

Для выделения вторых используются питательные среды, содержащие от менее 1 мг до 50 мг органического вещества в литре.

Четких границ между группами евтрофных и олиготрофных бактерий, основываясь только на их способности к росту на средах с высоким или низким содержанием сложных органических веществ (пептона, дрожжевого экстракта и т.д.), провести, по-видимому, невозможно. Для учета евтрофных и олиготрофных бактерий обычно используют плотные (агаризованные или силикагелевые), либо жидкие среды.

Определение коэффициента Кт

Как было указано выше, для более полной характеристики состояния трофности экосистемы, необходимо учитывать количество олиготрофных и евтрофных бактерий в комплексе. Нам представляется целесообразным использовать некий коэффициент Кт – отношение количества эвтрофных бактерий к олиготрофным, который довольно точно характеризует состояние бактериального сообщества.

Кт = Nэ / Nо ,

где Nэ – количество евтрофных бактерий, КОЕ/ см³;

Nо – количество олиготрофных бактерий, КОЕ/ см³.

Чем меньше коэффициент, тем благополучней система. Если Кт больше единицы, то система находится под мощным антропогенным прессом, количество аллохтонного вещества (а, значит, и евтрофных микроорганизмов) настолько велико, что жизнедеятельность естественного олиготрофного микробного сообщества сильно подавляется. Кт, изученный для водных масс Кольского залива и реки Кола на протяжении нескольких лет, демонстрирует неоднозначную картину. Так было показано, что Кт_, больший или равный единице, свидетельствует о серьезной дестабилизации бактериоценоза. Разнонаправленные флуктуации Кт при общем его снижении могут указывать на то, что бактериоценозы находятся в нестабильном состоянии, когда в зависимости от внешних факторов неустойчивый баланс между олиготрофами и эвтрофами резко отклоняется в ту или иную сторону. Кт может быть использован для оценки стабильности экосистемы, а также для прогнозирования ситуации в данном водоеме.

Отклик бактериоценоза на смену условий может выражаться в смене доминирования одной группы на другую. Регистрировать такие сукцессии зачастую можно только с помощью косвенных показателей.

Лабораторная работа 3

Лабораторная работа 4

КРИТЕРИИ И ШКАЛА ОЦЕНИВАНИЯ

Оценка	Критерии оценки
Отлично	Правильность выполнения задания на лабораторную работу в соответствии с вариантом; высокая степень усвоения теоретического материала по теме лабораторной работы. Способность продемонстрировать преподавателю навыки работы в инструментальной программной среде, а также применить их к решению типовых задач, отличных от варианта задания. Высокое качество подготовки отчета по лабораторной работе. Правильность и полнота ответов на вопросы преподавателя при защите работы.
Хорошо	Демонстрирует достаточно высокий/выше среднего уровень выполнения задания на лабораторную работу в соответствии с вариантом и хорошую степень усвоения теоретического материала по теме лабораторной работы. Все требования, предъявляемые к работе, выполнены.
Удовлетворительно	Демонстрирует средний уровень выполнения задания на лабораторную работу в соответствии с вариантом. Большинство требований, предъявляемых к заданию, выполнены.
Неудовлетворительно	Демонстрирует низкий/ниже среднего уровень знаний, умений, навыков в соответствии с критериями оценивания. Многие требования, предъявляемые к заданию, не выполнены.

Зависимость баллов в БРС университета за выполнение и защиту лабораторной работы от оценки в традиционной шкале «отлично-хорошо-удовлетворительно-неудовлетворительно» можно представить в таблице.

Оценка	отлично	хорошо	удовлетворительно	неудовлетворительно
Баллы в БРС

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Основная литература:

1. Белясова, Н.А. Микробиология. – М.: Высш. Шк, 2012.

2. Богданова, О.Ю. Микробиология водных экосистем: учеб. пособие для студентов/ О.Ю. Богданова. - Мурманск: Изд-во МГТУ, 2016.

3. Госманов Р.Г. Микробиология: Учеб. для студ. и вузов /Р.Г.Госманов и др. – СПб, Москва, Краснодар: Издательский центр «Лань», 2011.

4. Госманов Р.Г. Санитарная микробиология: Учебное пособие /Р.Г.Госманов, А.Х.Волков, А.К.Галлиулин, А.И.Ибрагимова. – СПб, Москва, Краснодар: Издательский центр «Лань», 2010.

5. Нетрусов, А.И. Микробиология. Учебник/ А.И. Нетрусов, И.Б.Котова. – М.:Академия, 2012.

6. Перетрухина А.Т., Луценко Е.С. Микробиологический и вирусологический мониторинг Кольского залива и водных экосистем г. Мурманска: монография под ред. А.Т. Перетрухиной. – Мурманск: изд-во МГТУ, 2011.

7. Перетрухина, А.Т. Гидросфера как среда обитания. Учебное пособие/А.Т. Перетрухина, О.Ю. Богданова, В.Е. Осауленко. – Мурманск: Изд-во МГТУ, 2013.

8. Широкая, Т.А. Гидрохимические исследования бассейна Кольского залива: Учебное пособие/Т.А.Широкая, С.И.Овчинникова. – Мурманск: Изд-во МГТУ, 2011.

Дополнительная литература:

1. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология : учеб. – М.: ОО Мед.информ.агентство, 2001.

2. Вербина, Н.М. Гидромикробиология с основами общей микробиологии / Н.М. Вербина. – М.: Пищ.пром-ть, 1980.

3. Жизнь микробов в экстремальных условиях : под ред. Д. Кашнера.- М.: Мир, 1981.

4. Заварзин, Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии /Г.А. Заварзн. – М.: Наука, 2004.

5. Емцев, В.Т. Микробиология: учебник для студ. вузов/В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – 6-е изд., испр. – М.: Дрофа, 2006.

6. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. – М. : СпецЛит, 2002. – 350 с.

7. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская. – М.: МГУ, 1987.

8. Макаревич, Е.В. Гидромикробиологический контроль сточных вод. Методические указания /Е.В. Макаревич, М.Ю.Литвинова. - Мурманск: Изд-во МГТУ, 2008.

9. Нетрусов, А.И. Общая микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений/А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. – М.: ИЦ «Академия», 2007.

10. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита и др. – Москва: Мир, 2007.

11. Руководство по методам биологического анализа морской воды и донных отложений : под ред. А. И. Цыбань.- Л.: Гидрометеоиздат, 1980.

12. Федоров В.Д., Капков В.И. Практическая гидробиология: Пресноводные экосистемы. – Москва: ПИМ, 2006.

РЕЦЕНЗИЯ

на методические указания к лабораторным работам студентов по дисциплине «Гидромикробиология» для направления 06.03.01 «Биология», профиль «Микробиология»

Составители: И.В. Ускова, к.б.н., доцент кафедры микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО МГТУ; Блинова Е.И., старший преподаватель кафедры микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО МГТУ

Методические указания составлены в соответствии с ФГОС ВО по направлению 06.03.01 «Биология», а также рабочей программой по дисциплине «Гидромикробиология».

В результате изучения теоретического материала и освоения курса лабораторных работ по дисциплине «Гидромикробиология» студенты получат знания о водных экосистемах, о функционировании бактериоценозов водных экосистем, об особенностях физиологических групп микроорганизмов, роли микроорганизмов в круговороте органических веществ в водоемах, а также ознакомятся с основными современными методами изучения водных микробиоценозов.

Рецензируемые методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Гидромикробиология» будут способствовать систематизации и закреплению студентами полученных знаний.

Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Гидромикробиология» для направления подготовки 06.03.01 «Биология» составлены в соответствии со всеми необходимыми требованиями и рекомендуются для издания через ИПЦ ФГБОУ ВПО МГТУ.

Канд. биол. наук, научный сотрудник кафедры микробиологии и биохимии ФГБОУ ВПО МГТУ

Мирошниченко Е.С.