Применение регуляторных микро-рнк в иммунологических исследованиях

Клетки животных содержат множество некодирующих РНК, таких, как транспортная РНК и рибосомальная РНК, а также регуляторные РНК, влияющие на экспрессию других генов. Один из классов малых некодирующих РНК - микроРНК (miRNA) - охарактеризован как наиболее многочисленный и филогенетически обширный. На генах микроРНК синтезируются миниатюрные транскрипты длиной приблизительно в 22 нуклеотида, функционирующие как негативные регуляторы других РНК. Первая молекула miRNA - lin-4 - открыта только в 1993 г. и охарактеризована V. Ambros и соавт. при скрининге генов нематоды Caenorhabditis elegans. Последующее изучение функций этого класса молекул показало их участие во многих физиологических процессах: пролиферации, дифференцировки, клеточной

гибели и т.д. (табл. 6.1). Нарушение функций микроРНК может привести к различным заболеваниям, в том числе раковым.

Таблица 6.1.Функции и мишени miRNA, участвующих в иммунном ответе (модифицирована по Lindsay M.A., 2008)

В настоящее время известно более 700 различных молекул miRNA, и они регулируют более 30% генов человека. Микро-РНК - пожалуй, самый большой класс регуляторов белков.

Молекулярный механизм формирования зрелой молекулы miRNA следующий. Первоначально РНК-полимеразой II транскрибируется длинный олигонуклеотид, называемый первичной микро-РНК (primiRNA). Молекула pri-miRNA кепирована и полиаденилированна, как и другие транскрипты РНК-полимеразы II. Участки, кодирующие miRNA, могут располагаться как в интронах белоккодирущих генов, так и в экзонах и интронах генов, которые белок не кодируют. Pri-miRNA имеет длину около 60-80 оснований и содержит в своей структуре одну или несколько петель. Такая структура распознается ферментом РНКазой III, называемой Drosha, и ее кофактором DGCR8. Молекула pri-miRNA разрезается этим ферментом до молекулы предшественника микроРНК - pre-miRNA. Pre-miRNA на своем 3' конце содержат два основания, которые распознаются белком экспортином-5. Данный белок, связываясь с pre-miRNA, транспортирует ее через ядерную мембрану в цитоплазму, где находится другая РНКаза III - Dricer, разрезающая pre-miRNA и оставляющая от нее участок в 20-23 нуклеотида. Таким образом, формируется зрелая miRNA, встраивающаяся в белковый комплекс RISC (RNA-induced silecing complex). Только в составе такого комплекса miRNA способна оказывать свое действие на мРНК, заключающееся в разрушении мРНК-мишени или в торможении ее трансляции. Негативная регуляция мРНК реализуется за счет комплементарности между miRNA и мРНК-мишенью. Когда связь miRNA с участком 3' UTR (3'-нетранслируемый регион) мРНК-мишени несовершенна вследствие неполной комплементарности, происходит репрессия трансляции. Когда же комплементарность сохранена полностью, мРНК-мишень разрушается комплексом RISC.

В последние годы особый интерес вызывает возможность регулирования врожденного и адаптивного иммунного ответа с помощью семейства miRNA.

На сегодняшний день хорошо охарактеризована небольшая группа молекул miRNA, участвующих в регуляции генных механизмов врожденного иммунитета. Мы приводим данные о наиболее изученных miRNA, играющих важную роль в регуляции генов врожденного иммунитета.

MiRNA-146

Семейство miRNA представлено двумя молекулами: miRNA-146а и miRNA-146b. Они локализованы на хромосомах 5 и 10 соответственно. Молекулы отличаются лишь по двум нуклеотидным основаниям в 3' регионе. Важность этих miRNA для врожденного иммунитета впервые показал K.D. Таganov и соавт. (2006). Уровень miRNA в клетках линии THP-1 человека повышается в ответ на стимуляцию липополисахаридом (ЛПС) - лигандом TLR4. Такой же эффект наблюдается в ответ на активацию паттернами бактерий и некоторых грибов TLR2, 4 или 5, а также после действия провоспалительных цитокинов (ФНОα и ИЛ-1β). Экспрессия miRNA-146 не повышается в ответ на активацию TLR3, рецепторов 7 и 9. Увеличения уровня miRNA-146а не происходит при стимуляции ИЛ-1β эпителиальных клеток легких и бронхов. В промоутерном регионе miRNA-146а выявлены несколько потенциальных транскрипционных факторов, которые могут быть вовлечены в регуляцию экспрессии этой молекулы: IRF3, IRF7 (interferon regulatory factor) и CCAAT enhancer-binding protein-b (C/EBPb). Однако непосредственный регулятор экспрессии микроРНК-146 до сих пор не известен. При изучении мишеней для miRNA-146 показано: молекула может блокировать мРНК генов адаптерных белков IRAK1 (IL-1 receptor associated kinase 1) и TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6). IRAK1 и TRAF6 - адаптерные белки, участвующие в передаче сигнала с TLR и рецептора ИЛ-1. Отрицательная регуляция данных молекул с помощью miRNA-146 приводит к тому, что сигнал с TLR не проводится в клетку и провоспалительные медиаторы не секретируются. Это может иметь чрезвычайно важное значение при разработке новых TLR-опосредованных подходов в регуляции врожденного иммунитета через адаптерные молекулы.

MiRNA-155

MiRNA-155 образуется из первичного транскрипта, который считывается со второго экзона белокнекодирующего гена, называемого «BIC». Ранние исследования miRNA-155 показали усиленную экспрессию этой молекулы у человека при В-клеточной лимфоме. Трансгенная экспрессия miRNA-155 в В-клетках мышей приводит к малигнизации, что дало основание для предположения о роли miRNA-155 в дифференцировке и пролиферации В-лимфоцитов. Ведущая роль miRNA-155 в регуляции Т- и В-клеточного ответа

выявлена в исследованиях на мышах, дефицитных по miRNA-155. У них не развивается оптимальный иммунный и протективный ответ на патогены после иммунизации. В последние годы показано значение miRNA-155 в реакциях врожденного иммунитета. Экспрессии miRNA-155 возрастает после стимуляции ЛПС и липопротеином (лиганд TLR2) в моноцитах, макрофагах и в спленоцитах мышей, которых иммунизировали Salmonella enteritidis, содержащей ЛПС. В отличие от таковой miRNA-146а экспрессия miRNA-155 увеличивается и после активации врожденного иммунного ответа вирусными и бактериальными нуклеотидами, имеющими в своей структуре лиганды для TLR3 - poly (I:C) и для TLR9 - CpG. Экспрессия miRNA-155 может возрастать в ответ на стимуляцию ИФβ и ИФγ. Количество miRNA-155 варьирует после стимуляции ФНОа и зависит от сроков инкубации с цитокином. В подобных случаях miRNA-155 оказывает как позитивное, так и негативное действие на экспрессию своих мишеней (NF-κΒ, IKKb, IKKe, а также FADD домен - Fasassociated death domain и Ripk 1 - receptor iteracting serine - threonine kinase 1). В отличие от miRNA-146, miRNA-155 позитивно регулирует экспрессию провоспалительных цитокинов в процессе врожденного иммунного ответа. Такой эффект продемонстрирован на эмбриональных клетках человека (HEK-293), в которых miRNA-155 увеличивает продукцию ФНОа путем снижения связанной с 3' UTR посттрансляционной ингибицией. Усиленная экспрессия miRNA-155 наблюдается в В-клетках мышей, трансгенных по miRNA-155. При очень высоких уровнях miRNA-155 мыши высокочувствительны к септическому шоку. Трансфекция miRNA-155 в гемопоэтические стволовые клетки и трансплантация их летально облученным мышам приводят к появлению у них признаков миелоидной неоплазии. Эти данные позволили авторам предположить, что связь между воспалением и канцерогенезом вызвана хронически высоким уровнем miRNA-155.