Определение каспаз методом проточной цитофлуорометрии

В результате запуска апоптоза, опосредованного перфорин/гран- зимовым и Fas/FasL механизмами, в КМ активируются каспазы. Данным методом определяют внутриклеточную активацию каспаз в КМ, используя белки, содержащие меченные флуорофором участки, подверженные расщеплению каспазами. Нерасщепленный флуорофор образует «молчащий» димер, после расщепления каспазами мономеры флуоресцируют.

Определение цитотоксической активности NK-клеток

NK составляют около 10-15% лимфоцитов периферической крови человека. NK - клетки врожденного иммунитета, в них не происходит перегруппировки генов I-клеточного рецептора (ТКР), кодирующих антигенраспознающие рецепторы. Функция NK - распознавание и уничтожение в организме клеток, пораженных вирусом, опухолевых клеток, лишенных МНС хозяина. NK проявляют функциональную активность без предварительной сенсибилизации и обладают так называемой естественной цитотоксичностью. Кроме того, NK способны уничтожать КМ, покрытые IgG антителами, вовлекая рецептор для IgG - FcγRIII (CD16). Такой тип цитотоксичности получил название антителозависимой клеточной цитотоксичности.

Функциональная активность NK оценивается по способности убивать КМ (например, клетки эритромиелоидной линии К562 человека, меченные радиоактивными изотопами ⁵¹Cr или ³Н-уридином).

Лабораторная работа 3-2

КМ К-562 метят изотопом ³Н-уридином (1 мкКи/мл) и инкубируют 1 ч при 37 °С. Затем клетки трижды отмывают культуральной средой, содержащей 10% СЭК. Отмытые КМ выдерживают в культуральной среде 2 ч при 37 °С и отмывают еще раз с целью удаления ³Н-уридина, не включившегося в РНК КМ. Готовят рабочую суспензию меченых КМ с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 1×10⁶ КМ и 5 мкг панкреатической РНК-азы.

Цитотоксическую реакцию проводят в круглодонных 96-луночных микропланшетах. В каждую ячейку помещают по 100 мкл рабочей суспензии меченых КМ с РНК-азой и 100 мкл суспензии мононуклеарных клеток (рабочая концентрация - 1х10⁷/мл). Используют различные соотношения КЭ:КМ - 100:1; 50:1; 25:1; 12,5:1. Клетки каждого разведения помещают как минимум в 3 лунки. В контрольных пробах меченые КМ инкубируют без мононуклеарных клеток.

Культуры инкубируют 14 ч при 37 °С и с 5% содержанием СО₂. После инкубации содержимое лунок переносят на фильтры с помощью собирателя клеток - харвестра. Фильтры высушивают, помещают в сцинтилляционную жидкость, проводят учет реакции с помощью β-счетчика. Показатель функциональной активности естественных киллеров выражают в виде индекса цитотоксичности (ИЦ), который определяют по формуле:

Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии

В качестве метки для КМ применяют флуоресцентный краситель 5-, 6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который образует прочную ковалентную связь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клетки.

Первоначально нефлуоресцирующий КФДЭ проникает через клеточную мембрану. Карбоксифлуоресцеины связываются с внутриклеточными молекулами, формируя конъюгаты, обеспечивая стойкое флуоресцентное окрашивание клетки. Окрашенные таким образом КМ К-562 смешивают с КЭ и инкубируют в течение нескольких часов. После окончания культивирования клетки окрашивают пропидий йодидом для определения убитых в ходе реакции КМ. По количеству убитых К-562 определяют активность NK-клеток. Анализ проводят на проточном цитофлуориметре и определяют количество КМ, включивших КФДЭ (зеленое свечение), и количество убитых клеток, включивших пропидий йодид (красное свечение).

Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность

In vivo случается чаще всего в патологических условиях и направлена на безъядерные клетки - эритроциты и тромбоциты, реже на ядросодержащие клетки крови, например нейтрофилы. Проявляются эти процессы в форме гемолитических анемий, тромбоцитопений, нейтропений. Этиология, как правило, либо инфекционная, либо лекарственная.