Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, слизь из носоглотки. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у малень­ких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной про­волоке, вводят через нос.

МЕТОДЫДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование(схема 14.2.2). Бактерио-скопический метод как таковой при диагностике коклюша не применяется. Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлюоресцентный метод (см. ниже).

Бактериологическое исследование.Основной метод лабора­торной диагностики коклюша. Материал для посева берут с помощью носоглоточного тампона или методом "кашлевых пластинок". Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выделить возбудителя в начальном периоде болезни от 80—90 % больных. Материал засевают на КУА или кровяные среды — картофельно-глицериновый кро­вяной агар (среда Борде—Жангу) и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии B.pertussis на указан­ных средах обычно появляются через 48—72 ч культивирова­ния. В.parapertussis — несколько раньше: через 24—72 ч. Борде-теллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серова­то-кремовый цвет, а на среде Борде—Жангу приобретают жем­чужный или ртутный блеск. Колонии В.parapertussis более круп­ные. На среде Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотри-цательных палочек ставят ориентировочную реакцию агглюти­нации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальней­шего изучения чистых культур.

Идентификацию выделенной культуры производят на осно­вании комплексного изучения морфологических, культураль-ных, биохимических и серологических свойств (табл. 14.2.2). В отличие от других бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изменяет цвета специальных питатель­ных сред.

Таблица 14.2.2. Дифференциальные признаки Bordetella spp.

Признак

В. per­tussis

В. parapertussis

В. bron- chisep- tica

Рост:

на агаре (простом) — + +

— Коричневая

окраска
на агаре с тирозином + +

Ярко-коричневая окраска Изменение окраски:

КУА— Буро-коричневая —

кровяного агара — Потемнение —

Образование уреазы + + +

Наличие антигенов:

родового (общего) 7 7 7

видового (специфического) 1 14 12

Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; цифрами обозначены номера антигенов.

Для определения уреазы в агглютинационные пробирки вносят 0,3 мл 2 % раствора мочевины, 0,3 мл густой суспензии испытуемой культуры и 2—3 капли 0,1 % спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщеп­ление мочевины уреазой.

Серологическую идентификацию бордетелл, дифференциа­цию видов и определение сероваров (серотипирование) прово­дят в реакции агглютинации с адсорбированными факторными сыворотками. При этом исходят из того, что антиген (фактор) 7 является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только В.рег-tussis, 14 — В.parapertussis и 12 — B.bronchiseptica.

При бактериологической диагностике коклюша может воз­никнуть необходимость дифференциации бордетелл от Haemo­philus influenzae. H.influenzae часто встречается на слизистой оболочке дыхательных путей и вызывает пневмонии и другие воспалительные заболевания дыхательных путей. В отличие от бордетелл H.influenzae растет только на кровяных питательных средах — кровяном агаре, "шоколадном" агаре Левинталя, со­держащих гемин и коэнзим дегидрогеназы. Бактериологичес­кое исследование продолжается не менее 5 дней.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие имолекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Метод ИФ: тампоном делают два мазка, высушивают их на воздухе и фиксируют на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующими противокок-

люшными антителами, другой — паракоклюшными антитела­ми. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроско­пе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериаль­ных клеток с четким светящимся венчиком.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3—4-й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вак­цинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.

• Микробиологическая диагностика дифтерии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин и но­соглотки. Материал берут двумя ватными стерильными тампо­нами, один из которых используют для приготовления мазков, другой — для посева.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование(схема 14.2.3). Мазки ок­рашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно нали­чие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы "V" (см. рис. 2.2.4). Corynebacterium pseudodiphth-eriae и дифтероиды не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследова­ния. При этом C.diphtheriae можно отличить от других корине-бактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом кори-фосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфоло­гию, в частности при санации зева антибиотиками. В настоя­щее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практически не используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицатель-ных результатов).

Бактериологическое исследование.Является ведущим мето-

дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, гли­церином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии (рис. 14.2.1; на вклейке) за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки, биовар mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамполо-жительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры (способность к продукции дифтерийного токсина). Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА и др.). Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделен­ных бактерий fox-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. До последнего времени общепринятым методом оп­ределения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, явля­ются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.

Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 °С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения ток­сина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — "усов" (см. рис. 10.1.7).

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфоло­гическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углево­дов и др. (табл. 14.2.3). В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с

Таблица 14.2.3. Биологические свойства коринебактерий

C.diphtheriae биовар grav/s + биовар mitts + C.xerosis ± C.pseudodiphtheriticum ±

__ + + + + _ +

+ — + — + + — + — + + — — ±— —

Условные обозначения: (+) — 85—100 % штаммов положитель­ны, (±) — 16—84 % штаммов положительны; (—) — отсутствие признака.

противодифтерийной сывороткой с целью выявления видоспе-цифического антигена С. diphtheriae.

Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. C.diphtheriae вызывают почернение среды по ходу посева (в ре­зультате образования сульфида свинца), вокруг которого появ­ляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от поверх­ности агара в среде образуется коричневое "облачко".

Для определения уреазы (проба Закса) готовят спирто­вой раствор мочевины и раствор индикатора — фенолового красного, которые перед употреблением смешивают в соотно­шении 1:9 и разливают по 1—2 мл в агглютинационные про­бирки. Затем исследуемые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. После 20—30-минутной инкубации при 37 "С наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате чего среда приобретает красный цвет.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования.Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследова­ния. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения tax-гена C.diphtheriae с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Преципитирующие антименингококковые сыворотки.Приме­няют с диагностической целью для обнаружения менингокок-кового антигена в спинномозговой жидкости (методом встреч­ного иммуноэлектрофореза).