Правила биологической безопасности при ра­боте с патогенными микробами

При работе с патологическим материалом, содержащим микробы, и особенно при культивировании патогенных мик­робов во избежание заражения персонала лаборатории необхо­димо соблюдать правила техники биологической безопасности. В зависимости от степени патогенности и контагиозности воз­будителей принято выделять четыре уровня биологической опасности и соответствующих мероприятий, необходимых для предупреждения заражения в лаборатории.

Первый уровень(работа с непатогенными микроорганиз­мами). Необходимо соблюдение стандартных правил (см. тему 1.1).

Второй уровень(работа с низковирулентными микроорга­низмами). К числу дополнительных правил и мероприятий относятся использование лабораторной одежды и защитных перчаток; обязательное обеззараживание всех загрязненных от­ходов; ограничение доступа в лабораторию. Для предотвраще­ния попадания микробов в воздух рабочего помещения выпол­нение механических манипуляций, сопряженных с высокой вероятностью распыления микроорганизмов, необходимо осу­ществлять вспециализированных закрытых легкодезинфици-руемых настольных боксах.

Третий уровень(работа с высоковирулентными микроорга­низмами). К числу дополнительных правил и мероприятий относятся использование специальной защитной лабораторной одежды; контроль доступа в лабораторию. Все манипуляции с патологическим материалом необходимо осуществлять в спе­циализированных боксах.

Четвертый уровень(работа с возбудителями ООИ). Работа с возбудителями особо опасных инфекций (ООИ) разрешена ис­ключительно в специализированных режимных лабораториях,

имеющих оборудование, необходимое для эффективной защи­ты от патогенных микробов, их контроля и уничтожения. К числу дополнительных правил и мероприятий относятся наличие отдельных помещений для смены лабораторной одеж­ды и душевых, обязательное обеззараживание всех отходов лаборатории. Все манипуляции с патологическим материа­лом необходимо осуществлять в специализированных на­стольных боксах, снабженных системами стерилизации возду­ха (см. тему 7.1).

■ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Обнаружение патогенных микроорганизмов, являющихся возбудителями заболеваний (например, микобактерии туберку­леза, гонококки и др.), имеет решающее значение для поста­новки диагноза.

Выявление роли условно-патогенных микроорганизмов в этиологии и патогенезе заболеваний должно быть основано на строгой аргументации. Обязательным условием является кли­ническое, эпидемиологическое, микробиологическое и сероло­гическое исключение возбудителей инфекционных болезней (например, возбудителей кишечных инфекций, венерических болезней и др.). Для оценки роли условно-патогенных микро­организмов в патологии могут быть использованы следующие критерии.

1. Выделение микроорганизмов из крови, спинномозговой жидкости или других жидкостей организма, которые в норме у здоровых людей являются стерильными.

2. Обнаружение в исследуемом материале, особенно при дисбактериозах, условно-патогенных микроорганизмов в до­статочно больших количествах (например, 10⁵—10⁷ микробных клеток в 1 мл). Для этого проводят количественное определе­ние микроорганизмов по числу КОЕ в 1 г или 1 мл испытуе­мого образца. Эти количественные показатели могут варьиро­вать в зависимости от вида микроорганизмов, типа исследуе­мого материала, характера и стадии заболевания.

3. Повторное, многократное (в течение суток или через сутки) выделение одного и того же микроорганизма из одного и того же материала от больного (например, из крови при сепсисе и т.д.).

4. Обнаружение идентичных условно-патогенных микроор­ганизмов в разных образцах материала (например, при пище­вых токсикоинфекциях — в промывных водах желудка, рвот­ных массах, испражнениях, пищевых продуктах).

5. Нарастание титра антител в 4 раза и более в парных сыворотках крови больного в отношении условно-патогенного микроорганизма, который предполагается как возбудитель дан-

ного патологического процесса. В ряде случаев рекомендуется использовать в качестве антигенов аутоштаммы микроорганиз­мов, выделенные от больных.

6. Положительные кожно-аллергические реакции у больных с аллергенами, приготовленными из условно-патогенных мик­роорганизмов.

7. В случае внутрибольничных (нозокомиальных) инфек­ций — выделение идентичных культур микроорганизмов от группы больных.

8. Совпадение данных лабораторного определения чувстви­тельности микроорганизмов к антибиотикам с эффективнос­тью антимикробной терапии в клинических условиях, под­тверждаемое улучшением состояния больного и уменьшением количества или элиминацией соответствующих микроорганиз­мов.

9. Условно-патогенные микроорганизмы (синоним: оппор­тунистические) представляют собой большую группу микроор­ганизмов, занимающих различное систематическое положение. Они встречаются среди аэробных и анаэробных бактерий, гри­бов, простейших. В клинической микробиологии наиболее час­то встречаются условно-патогенные микроорганизмы, относя­щиеся к родам Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Klebsiel­la, Proteus, Entewbacter, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas, Haemo­philus, Bacteroides, Veillonella, Vibrio, Peptococcus, Peptostreptococ-cus, Mycobacterium, Mycoplasma, Candida и др.

■ ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ МИКРО­БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты лабораторных исследований оформляют на спе­циальных бланках, которые передают лечащему врачу.

1. В ответе прежде всего указывают наличие патогенных, а также условно-патогенных микроорганизмов, обнаруженных при микробиологическом исследовании. Сообщают также дан­ные лабораторного определения чувствительности микроорга­низмов к антибиотикам.

2. При обнаружении микробных ассоциаций перечисляют все микроорганизмы, указывают доминирующие виды и коли­чественные микробиологические показатели.

3. В соответствии с правилами международной номенкла­туры в ответах приводят видовые названия микроорганиз­мов, например: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и т.д.

4. С целью ускорения лабораторных исследований в ряде случаев при выделении условно-патогенных микроорганизмов вполне допустимо в ответе ограничиться указанием только родовой принадлежности обнаруженных микроорганизмов, на­пример Proteus sp., Candida sp. и т.д.

ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Глава 12

Раневые и гнойные инфекции часто встречаются в хирур­гической, акушерско-гинекологической, терапевтической, пе­диатрической практике, а также других отраслях медицины. Нередко они носят характер внутрибольничной (госпитальной) инфекции. Возбудителями раневой и гнойной инфекции явля­ются бактерии, которые относятся к разным семействам, родам и видам. Среди них известны аэробные и анаэробные, грам-положительные и грамотрицательные бактерии. БАКТЕРИИ - ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВОЙ И ГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

Аэробные бактерииГрамположительные бактерии

Chryseobacterium indologenes Chryseobacterium meningosepticum Enterococcus faecalis и другие виды Enterococcus Erysipelothrix rhusiopathiae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophiticus и другие виды Staphylococcus Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae

Грамотрицательные бактерии

Burkholderia cepacia Citrobacter koseri Edwardsiella tarda Eikenella corrodens Enterobacter spp. Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella spp. Listeria monocytogenes Moraxella catarrhalis Proteus vulgaris Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens Salmonella enterica

подвид enterica биовар typhimurium Serratia spp. Spirillum minus Streptobacillus moniliformis Vibrio vulnificus

Анаэробные бактерии

Неспорообразующие грамотрица­тельные анаэробы

Bacteroides fragilis

и другие виды рода Bacteroides

Prevotella melaninogenica

и другие виды рода Prevotella

Porphiromonas spp.

Fusobacterium spp.

Veilonella spp.

Неспорообразующие грамположи­тельные анаэробы

Peptostreptococcus spp. Propionibacterium acnes

Спорообразующие грамположи­тельные анаэробы

Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium ramosum Clostridium sporogenes Clostridium tetani

Бактерии, перечисленные выше, вызывают гнойно-воспали­тельные процессы различной локализации, в том числе анги­ны, фурункулы, циститы и пиелиты, плевриты, перикардиты, сепсис и др. Многие из этих возбудителей встречаются в нор­мальной микрофлоре человека и проявляют свою патогенность только при нарушении нормальной экологии.

Стафилококки, стрептококки, протей, эшерихии и анаэроб­ные бактерии нередко вызывают смешанную инфекцию как в разнообразных сочетаниях между собой, так и с другими мик­роорганизмами — вирусами, грибами.

Тема 12.1.АЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ -ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

▲ План

▲ Программа

1. Биологические свойства возбудителей гнойно-воспа­лительной и раневой инфекции, их патогенность, эко­логия, особенности инфекции и эпидемиология вы­зываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические препараты, профилактические и ле­чебные препараты.

А Демонстрация

1. Рост а- и р-гемолитических стрептококков на кровя­ном агаре.

2. Рост и образование пигмента P.aeruginosa на агаре.

3. Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

ЗАНЯТИЕ 1

▲ Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать мазки из чистых куль­тур возбудителей гнойных инфекций: S.aureus, S.pyo­genes, P.aeruginosa, E.coli, P.vulgaris. Окраска по методу Грама.

2. Микроскопировать и зарисовать мазки из гноя, содер­жащие возбудителей: стафилококков, стрептококков. Окраска по методу Грама.

3. Ознакомиться с питательными средами, применяемы­ми при микробиологической диагностике гнойных и раневых инфекций. Указать назначение отдельных пи­тательных сред.

4. Микробиологическое исследование при раневых и гнойных инфекциях:

а) указать материал, подлежащий исследованию;

б)микроскопический метод: микроскопировать мазок
из гноя, окраска по методу Грама. Сделать вывод;

в) наметить план дальнейшего исследования.

ЗАНЯТИЕ 2

Задание студентам

1.Микробиологическое исследование гноя:

а) учесть результат посева гноя на кровяной агар в
чашке Петри, описать подозрительные колонии,
отметить наличие гемолиза, составить план даль­
нейшего исследования;

б) учесть результаты определения лецитиназы и плаз-
мокоагулазы у выделенной культуры стафилококка.
Сделать вывод;

в) учесть результаты определения чувствительности
культуры стафилококка к антибиотикам. Сделать
вывод.

2. Микробиологическое исследование мочи. Определить количество бактерий в 1 мл мочи по результатам ме­тода секторных посевов. Дать заключение.

3. Серодиагностика ревматизма. Ознакомиться с описа­нием стрептолизиновой реакции. Внести в протокол результаты определения анти-О-стрептолизина всы­воротке крови больного. Сделать вывод.

4. Дать краткую характеристику демонстрируемым анти­микробным, диагностическим и лечебно-профилакти­ческим препаратам.

Методические указания

Материал для исследования: раневое отделяемое, гной, экс­судат, моча, мазки со слизистых оболочек (носоглотки, зева и др.), кровь при подозрении на сепсис.

• Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование(схема 12.1.1). Изиссле­дуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Наличие впрепаратах грамположительных кокков, располагающихся в виде гроздевидных скоплений (рис. 12.1.1; на вклейке), позволяет поставить предварительный диагноз стафилококковой инфекции. Следует иметь в виду, что в патологическом материале стрептококки редко образуют ти­пичные скопления, чаще располагаются поодиночке или не­большими группами по 2—3 бактерии.

Бактериологическое исследование.Испытуемый материал засе­вают петлей на чашки с кровяным и желточно-солевым агаром

Рис. 1.4.Культура дрожжей Sac--charomyces cerevisiae прираз­ных методах микроскопии К с. 14. а — микроскопия мазка, окрашен­ного метиленовым синим; б - тем-нопольная микроскопия; в — фазо-во-контрастная микроскопия- г — люминесцентная микроскопия. Ок­раска корифосфином.

Рис.2.2.1. Смесь стафилококков и кишечных палочек. К с. 23. Окраска по методу Грама.

Рис.2.2.2. Возбудитель туберку­леза (Mycobacterium tuberculosis)

в мокроте. К с. 25. Окраска по методу Циля—Нильсена.

Рис.2.2.4. Возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphtheriae). К с. 26.

Окраска по методу Нейссера. Вид­ны зерна волютина.

Рис.2.2.3. Споры и вегетативные

клетки возбудителя сибирской

язвы (Bacillus anthracis). К с. 25.

Окраска по методу Ожешко.

Рис.2.2.5. Капсула Klebsiellae pneumoniae. К с. 26. Окраска по методу Бурри—Гинса.

Рис.3.2.1. "Пестрый ряд". К с. 46.

а — ферментация углевода до кислоты и газа; б — отсутствие ферментации;

в — образование индола; г — образование сероводорода.

Рис.6.2. Постановка опыта специфической трансдукции (схема).Я' с. 26

пп™Ь^Г i ^dga'^{; б} ~ ^{реципиент E}-^{coli 1ас}"; ^в - Рост колоний реципиентного „» рп Т^- ^{ВДо; г} *" ^Раженная транслирующим фагом X dgal культура b.coli lac ; д - рост колоний трансдуктантов (красного цвета), несу­щих ген gal, на среде Эндо.

Рис.6.1. Постановка опыта трансформации. К с. 68. контает^Спе?™г5^НК' ^в™^еленно? из B.subtilis; б - реципиент B.subtilis; в -

селенной с^Л^{ЫХ ба,СГерИЙ С ДНК; Г} ~ ^{рост колоний} Рекомбинантов на штамма н L?™ ^со_й^С1Р^ептоми«ином; д - отсутствие роста реципиентного 1мма на селективной среде со стрептомицином; е - рост колоний реципиент­ного штамма на среде без стрептомицина.

Рис.6.3. Постановка опыта по конъюгации. К с. 70. а — рост колоний бактерий донора на минимальной среде без стрептомицина; б — рост колоний рекомбинантов на селективной среде со стрептомицином без лейцина; в — рост колоний бактерий реципиентов на полной среде со стрептомицином и лейцином; г — отсутствие роста бактерий донора на среде со стрептомицином; д — донор-культура E.coli F , lei , su⁵; е — контакт между бактериями донора и реципиента; ж — реципиент-культура E.coli F", lei", st/; з — отсутствие роста бактерий реципиента на селективной среде со стрептомицином без лейцина.

Рис. 10.4.1. Кожно-аллергическая проба. К с. 144.

Рис. 12.1.2. Колонии стафилокок­ка на кровяном агаре. А'с. 162.

Рис. 12.1.1. Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes в гное. Окраска по методу Грама. К с. 160.

Рис. 12.2.1. Clostridium perfringens в отечной жидкости. К с. 174.

Рис. 13.2.1. Рост бактерий семей­ства Enterobacteriaceae на диф­ференциально-диагностических

средах. К с. 194. а — колонии Escherichia coli и Sal­monella typhi на среде Эндо; б — колонии Salmonella typhi на висмут-сульфитном агаре.

Рис. 13.3.1. Vibrio cholerae. К с. 203 Окраска по методу Грама.

Рис. 14.1.1. Streptococcus pneumo­niae в мокроте. К с. 214.

Рис. 14.2.1. Рост Corynebacteri-

um diphtheriae на кровяно-тел-

луритовой среде. К с. 231.

Рис. 14.3.2. Микрокультура My­cobacterium tuberculosis. К с. 240. Окраска по методу Циля — Нильсена.

Рис. 14.3.1. Рост Mycobacterium

tuberculosis на среде Левенштей-

на — Йенсена. К с. 239.

Рис. 15.2.1. N. gonorrhoeae в гное

из мочеиспускательного канала.

К с. 253.

Окраска фуксином.

Рис. 16.1.1. Yersinia pestis в гное

из бубона. К с. 261.

Окраска метиленовым синим.

Рис.16.1.3. Brucella melitensis (чистая культура). К с. 266.

Рис. 16.1.4. Bacillus anthracis (ма­зок из гноя). К с. 269.

Рис. 16.1.2. Francisella tularensis

(чистая культура). К с. 263.

Окраска по методу Грама.

Рис. 17.1.1. Borrelia recurrentis в

крови больного. К с. 283.

Окраска по методу Романовского -

Гимзы.

Рис. 18.1.1. Титрование вируса гриппа в РТГА с куриными эритроци­тами. К с. 292. Объяснение в тексте.

Рис.19.1.1. Тельца Бабеша —Нег-ри в нейронах гиппокампа. Срез головного мозга человека. К с. 305. Окраска по методу Романовского — Гимзы.

(ЖСА) для получения изолированных колоний. Посевы инку­бируют при 37 °С в течение суток. На следующий день исследуют выросшие колонии на обеих средах. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие гемолиза (рис. 12.1.2; на вклейке). На ЖСА S.aureus образует золотистые круглые выпуклые непрозрач­ные колонии. Вокруг колоний стафилококков, обладающих ле-цитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перла­мутровым оттенком. Для окончательного установления вида ста­филококка 2—3 колонии пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром для получения чистых культур с последую­щим определением их дифференциальных признаков (табл. 12.1.1).

Таблица 12.1.1. Дифференциальные признаки стафилококков

Вид

S.aureus

S.sapro-phyticus

Признак

S.epider-midis

Образование:

плазмокоагулазы + — —

лецитиназы + — —

альфа-токсина + — —

Ферментация:

глюкозы + + —

маннита в анаэробных условиях + — +

Чувствительность к новобиоцину S S R

Условные обозначения:(+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; S — чувствительный; R — резистентный.

Для постановки реакции на плазмокоагулазу плазму крови, разведенную в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, вносят туда по одной петле каждой исследуемой культуры стафило­кокка и помещают в термостат при 37 °С. Через 2, 4 и 24 ч отмечают результаты опыта. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток. В некоторых случаях наряду с плазмокоагу-лазой и лецитиназой определяют фибринолизин, гиалуронидазу, ДНКазу.

Для установления источника внутрибольничной инфекции выделяют чистые культуры стафилококка от больных и бакте­рионосителей, после чего проводят их фаготипирование с по­мощью набора типовых бактериофагов. Фаги разводят до тит­ра, указанного на этикетке. Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар в чашку Петри газоном, высу­шивают, а затем петлей каплю соответствующего фага наносят на квадраты (по числу фагов, входящих в набор), предвари­тельно размеченные карандашом на дне чашки Петри. Посевы инкубируют при 37 "С. Результаты оценивают на следующий день по наличию лизиса культуры (см. рис. 5.3.2).

Определение чувствительности стафилококка к антибиоти­кам — см. тему 7.2.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования.

Иммунохимические исследования. Основаны на об­наружении антигенов (токсинов и ферментов) возбудителя в материале от больного с помощью чувствительных серологи­ческих реакций.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

• Микробиологическая диагностика стрептококковых инфек­ций (схема 12.1.2)

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Мазки для первичной бактериоскопии готовят из патологического материала (за ис­ключением крови), окрашивают по методу Грама и микроско-пируют. При положительном результате обнаруживают цепоч­ки грамположительных кокков (см. рис. 12.1.1). Следует иметь в виду, что в патологическом материале стрептококки редко образуют типичные скопления, чаще располагаются поодиноч­ке или небольшими группами по 2—3 бактерии.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал за­севают на кровяной агар в чашку Петри. После инкубации при 37 "С в течение 24 ч отмечают характер колоний и наличие вокруг них зон гемолиза. Из части материала, взятого из ко­лоний, готовят мазок, окрашивают по методу Грама и микро-скопируют. Для получения чистой культуры 1—3 подозритель­ные колонии пересевают в пробирки со скошенным кровяным агаром и сахарным бульоном. На кровяном агаре Streptococcus pyogenes образует мелкие, величиной с булавочную головку, мутноватые круглые колонии. В бульоне стрептококк в отличие от стафилококка дает придонно-пристеночный рост в виде хлопьев или зерен, оставляя среду прозрачной.

По характеру гемолиза на кровяном агаре стрептококки делятся на три группы: 1) негемолитические; 2) aj-гемолити­ческие, или зеленящие, образующие зеленоватую зону частич­ного гемолиза; 3) р-гемолитические, образующие вокруг коло­нии полностью прозрачную зону гемолиза.

Заключительным этапом бактериологического исследования является идентификация выделенной культуры по антигенным свойствам (табл. 12.1.2). Серогруппу стрептококков определяют в реакции преципитации с экстрактом из исследуемой культу­ры (полисахаридным преципитиногеном С) и группоспецифи-

ческими сыворотками (обычно 4 наиболее распространенные серогруппы — А, В, С иD). Развернутое серологическое иссле­дование и типирование стрептококков проводят главным об­разом для эпидемиологического обследования.

Таблица 12.1.2. Дифференциальные признаки стрептококков

Вид	Рост при	Рост на средах, содержащих	желчь (40%)
	10'С	45 °С	метиленовый синий (0,1 %)	хлорид натрия (6,5 %)

S.pyogenes — — — — —

S.pneumoniae — + ± — —

S.sanguis — ± — — +

S.salivarius — + — — —

Вид	Рост при рН 9,6	Термоустойчи­вость при 60 °С в течение 30 мин	Образование раствори­мого гемолизина	Антиген­ная груп­па (серо-группа)
	О	S

S.pyogenes — — + + А

S.pneumoniae — — + — —

S.sanguis ± H(—)

S.salivarius — — — — —(К)

Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; (+) — наличие признака у одних штаммов и отсутствие его у других штаммов данного вида.