Лабораторная работа 2-1
1. 10 мл гепаринизированной крови человека (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) разводят в 3 раза (1 часть крови и 2 части питательной среды 199).
2. Разведенную кровь наслаивают на раствор фиколл-урографина (плотность 1,077 г/см3) в соотношении 1:3 (1 часть фиколла и 3 части разведенной крови). Кровь остается над раствором фиколла и не смешивается с ним.
3. Проводят центрифугирование при комнатной температуре в течение 45 мин на центрифуге с горизонтальным ротором при 400 g.
Следует иметь в виду, что для определения необходимого числа оборотов в конкретных условиях центрифугирования или получения соответствующего центробежного ускорения одну из необходимых величин (ускорение или число оборотов) находят по формуле:
где g - центробежное ускорение; n - число оборотов в минуту; r - радиус от центра оси до границы разделяемых сред.
4. После центрифугирования собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, в отдельную пробирку. Эритроциты склеиваются фиколлом и оседают на дно пробирки вместе с гранулоцитами (см. рис. 2.2).
5. Суспензию мононуклеарных клеток трижды отмывают средой 199, центрифугируя по 10 мин при 200 g.
6. Клетки ресуспендируют в 1 мл культуральной среды. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева. Жизнеспособность клеток определяют с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Необходимо подсчитать процент выхода жизнеспособности клеток (более 90%). Для этого подсчитывают начальное количество клеток и количество выделенных клеток.
2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ
Лабораторные методы выделения моноцитов разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с фракционированием моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластиковой поверхности или по способности при центрифугировании к локализации в определенных зонах ступенчатого градиента.