Методичні вказівки до роботи студентів. Тема 4. Морфологія хромосом

Тема 4. Морфологія хромосом. Каріотип людини

ВИД ЗАНЯТТЯ:практичне, час проведення 2 години.

АКТУАЛЬНІСТЬ ТЕМИ: знання питань теми дозволяє майбутнім лікарям з’ясувати матеріальну основу розвитку організму, життєдіяльності організму в нормі і при різних патологічних станах; використовувати одержані знання для вирішення практичних медичних задач, зокрема при медико-генетичному консультуванні.

МЕТА (загальна):1. Розглянути основні положення правила хромосом та хромосомного аналізу, їх значення для побудови генетичних карт хромосом.

КОНКРЕТНА МЕТА:уміти:

- приготувати тимчосовий препарат із букального зіскобу та оприділити вміст статевого хроматину на цитологічному препараті.

- розкласти підгготовлені макети хромосом на планшеті та індентифікувати їх по групах за Денверською класифікацією (Денвер, США, 1960).

При підготовці до заняття користуватися літературою:

Основна:

1. Медична біологія: Підручник /за ред.В.П.Пішака, Ю.І.Бажори.- Вінниця: Нова книга, 2004.- С.74-79.

2. Биология В 2кн. Кн.1: Учеб. для мед.спец. вузов /Под ред. В.Н.Ярыгина. 6-е изд., стер. - М.: Высш. шк., 2004.- С.123-125, 137.

3. Слюсарєв А.О., Жукова С.В. Біологія: Підручник / Пер. з рос. В.О.Мотузний. - К.: Вища шк., 1992. - С.25-31.

4. Федченко С.Н. Общая и медицинская генетика // Учебное пособие для студентов медицинских вузов. – Луганск, 2003. – С.93-95..

5. Федченко С.М. Молекулярні основи генетики: Навчальний посібник для студентів І курсу. – Луганськ: ЛДМУ, 2003. – С.75.

Додаткова:

6. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. Т.2. М.: Мир, 1994.- С.40.

7. Лекційний матеріал.

8. Граф логічної структури

Теоретичні питання:

1. Каріотип: морфофункціональна характеристика і класифікація хромосом людини.

2. Правила хромосом.

3. Хромосомний аналіз.

4. Ядерце, як похідне хромосом, роль в утворенні рибосом.

5. Ідіограма.

Алгоритм практичної роботи:

Методика проведення експерименту

Проводять зіскоб (кожен студент собі) слизової оболонки щоки стерильним шпателем (одноразового користування), наносять на предметне скло, фіксують, окрашують препарат ядерними барвниками, після чого продивляються під імерсією.

Хід проведення практичної роботи:

1. Розташовують зіскоб на предметне скло та розтирають другим;

2. Наносять на об’єкт 2-3 краплі фіксатора Карнуа і витримують 2-3 хвилини;

3. Змивають фіксатор двома порціями спирту ( по1-2 краплі в хвилину);

4. Наносять 2-3 краплі дистильованої води і витримують 2-3 хвилини;

5. Наносять 2-3 краплі геметоксиліну і витримують 3 хвилини;

6. Змивають фарбник дистильованою водою ( декілька раз );

7. Додають 2-3 краплі водопровідної води і витримують 1-2 хвилини;

8. Наносять 2-3 краплі дистильованої води ( на 1-2 хвилини );

9. Обезводнюють двома змінами спирту ( 2-3 краплі по 1-2 хвилини );

10. Препарат просушують 1-2 хвилини при температурі 40-60⁰С;

11. Препарат просвітлюють в 2-3 краплях ксилолу;

12. Наносять імерсійну олію і продивляються препарат.

Методичні вказівки до роботи студентів.

Для вивчення структури кількості хромосом в клітинах людського організму та статевого хроматину застосовують цитогенетичний метод ( існує прямий і непрямий методи ).

При прямому одержаний матеріал піддають відповідний обробці і цим методом можна досліджувати хромосоми в клітинах кісткового мозку, ембріональних тканинах, пунтках лімфатичних вузлів тощо.

При непрямому методі, одержані клітини необхідно попередньо культивувати на відповідних живильних середовищах. Цим методом досліджують хромосоми в лімфоцитах периферичної крові, клітинах амніотичної речовини, фібробластах .

Так, із венозної, гепаринізованої крові (10 см ) після відстоювання на протязі 1 години в холодильнику, відділяють плазму і поміщають її в живильне середовище 199 або середовище Ігла у співвідношенні 1:1.5

Для стимулювання мітозу додають фітогемаглютинін із розрахунку 0,1мл на 10 см суміші, а також один з антибіотиків (наприклад, пеніцилін-100 ОД на 1см³ суміші).Культуру в флаконах із під антибіотика ставлять у термостат при 37⁰ С на 48 (або 72 год.). За 6 годин до закінчення інкубації додають колхіцин з розрахунку 0.5мгк/мм, який припиняє поділ лімфоцитів на стадії метафази.Опісля культуру знову ставлять в термостат на 2-4 години. Одержану культуру розливають в центрифужні пробірки і центрифугують при частоті 800-1000 об./хв. Надосадкову рідину зливають, а до осадку додають 5 см³ гіпотонічного розчину нітрату натрію (0,95%). Витримують 7хв.з хлоридом калію або 15хв. з нітратом натрію. Знову 5-7 хв. ценрифугують; при цьому ядерні оболонки тріскаються і хромосоми виходять в цитоплазму. До осадку додають 1-2 мл фіксатора (метиловий спирт або льодову оцтову кислоту, 3:1) та фіксують до 40 хвилин, міняючи фіксатор декілька раз. Після чого беруть 3-4 краплини клітинної суспензії, наносять на підготовлене відповідним чином предметне скло. Сушать феном,окрашують ядерними фарбами (2% розчином ацеторсеїна, азуреозином, барвником Унта, розчином Гімза, тощо). Накривають покривним скельцем і мікроскопують з масляною імерсією.

Мікропрепарат фотографують, роблять відбитки на фотопапері. Зображення кожної хромосоми вирізають і наклеюють на білий папір в ряд, починаючи від самої великої і закінчують статевими хромосомами (складають ідеограму).

Склавши ідеограму вивчають каріотип.