Вирусты өсіру тәсілі

1.Вирустардың өсуі мен бөлінуінің бірден-бір тәсілі лабораториялық жануарларды зақымдау болып саналады. Жаңа туған жануарлар жиі пайдаланылады, себебі олар сезімтал келеді. Тәжірибелік жануарларды сұрыптау кезінде вирустарға олардың сезімталдығы мен қабылдағыштығына көңіл аудару керек. Құтыру вирусымен тышқандар, үй қояндарызақымданады, ал, тұмау вирусымен тышқандар және күзендер зақымдалынады. Вирусы бар материалды жануарларға егу (тері асты, бұлшық етке, венаға, миға, мұрын қуысы арқылы) жолы жануарлардыңтүрі мен вирустардың тропизміне байланысты.

2.Сыртқы ортаның обьектілерінен және аурулардан алынған вирустарды өсіру үшін тауық

эмбрионы кеңінен қолданылады және осы жолмен өсірілген вирустардан вакциналарды

дайындау, диагноз қоюға диагностикумдарды дайындау, вирустардың түрін анықтау үшін

қажет.

Адам және жануарларда зақым келтіретін, көптеген вирустар көп немесе аз мөлшерде тауық эмбрионында көбейе алатындығы анықталған. Эмбрионның тығыз сыртқы қабаты сыртқы ортадан түсетін микроорганизмдерден қорғайды, сондықтан вирустар стерильді жағдайда көбейеді. Вирустарды өсіру үшін 4-12 тәуліктік эмбриондар пайдаланылады. Мысалы: тұмау вирусын бөліп алу үшін 11 тәуліктік эмбрионды қолданылады.

Өмір сүру қабілеті бар эмбриондарды жұмысқа іріктеп алу үшін оларды овоскоппен зерттейді. Жарық өткен қабықтың ішінде эмбрион, хорионалантоистық қабықтың ауа қуысының шекарасы көрінеді. Өмір сүргіштік қабілеті бар эмбриондар жылжымалы, қабыршықтарының тамырлары қанмен толтырылған.

Вирусы бар материалды алантоистық қуысқа (тұмау, ұшық, шешек вирустары), амнион қуысына (тұмау вирусы), сары қапшыққа (құтыру, ұшық вирустары), хорион-алантоистық қабыршықтарға (тұмау, шешек вирустары) енгізіледі. Хорион-алантоистық қабықты вирустарды көбейту үшін қолдану кең тараған әдістердің бірі болып табылады. Оның негізгі себебі, көптеген вирустар осы қабықта көбеюі белгілі бір морфологиялық өзгерістерге түседі. Көбінесе төмпешік (бляшка) тәрізді ақшыл дақтар пайда болады.

Вирустарды торша өсіндісінде өсіру.

Вирустарды өсіру үшін клетка культурасы пайдаланылады. Көптеген вирустар өздері көбею үшін сезімталдығы жоғары кульдураларды таңдап алатын болғандықтан, клетка культурасы универсальды культура болып табылады. Адамның, тауықтың, қойдың, сиырдың теңіз шошқасының, ақ тышқандардың трипсинденген эмбриональдық клеткалары және ересек маймылдардың бүйрек клеткасы жиі қолданылады. Сондай-ақ қатерлі ісік клеткаларының культурасы пайдаланылады. Трипсиндеудің негізі, протеолитикалық ферменттердің (трипсин, хемотрипсин т.б.) әлсіз ерітінділері арқылы клетка аралық байланысты үзе отырып, клеткалардың өмір сүру қабілетін сақтап қалуы болады.

Клеткадағы вирустардың цитопатикалық әсерінің байқалуы зақымдалған клеткадағы вирустардың бар екендігін анықтау үшін өте қолайлы.

Клетка культурасы басқа тәсілдерге қарағанда, вирустардың өсуіне біркелкі жағдай туғызады, өйткені клеткалар бір тканьге жатады. Қасиеттері ұқсас және арасында антиденелер, ерекшелігі жоқ тежеушілер болмайды.

Клетка жүзгінің inviro тіршілігін сақтау үшін құрамы күрделі қоректік орта (Игла, 199 ортасы) және тұзды ерітінділер (Хенкса, Эрла ерітіндісі, Тироде сұйығы) қолданылады. Қоректік орта клетка культурасының өсуін және көбеюін қамтамассыз етеді, ал тұзды ерітінді клетканың тек қана тіршілігін сақтауға қажет. Бактериялармен ластанудан сақтау үшін (әсіресе микоплазмадан) өсу ортасына антибиотиктер қосылады.

Клеткалар культурасының төмендегідей жіктелуі қолданылады:

А) тіршілігін сақтайтын тіндердің культурасы

Б) өсуші тіндердің культурасы, олардың өзі:

1.айқындалған тіндер бөлігінің культурасы – тіннің ұсақталған бөлімі тауық плазмасымен араластырылады, пайда болған қою бөліктерді бекітеді.

2.суспензияланған клетка культурасы – клетка суспензиясы үнемі магниттелген араластырғышпен немесе барабанмен, болмаса арнайы реактормен араластырып тұрады.

3. бір қабатты клетка культурасы. Клетка әсері алдында шынының бетіне бекітіледі

(пробирканың, матрацтың қабырғаларына) содан кейін қалыңдығы бір клеткадай қабат құрал

өседі, соның арқасында болып жатқан өзгерістерді байқауға болады. Бірыңғай қабат культу

радан біркелкі өмір сүргіштігі жақсы көп дәрежелі клеткалар алуға болады.

Вирусологиялық зерттеулер әдістері   Жоспары: 1. Вирусологиялық әдістері 2. Серологиялық (иммунологиялық) әдістері 3. Молекулалық-генетикалықлық әдістері   Барлық қолданылатын вирусологиялық зерттеу әдістерін шартты түрде үш топқа бөлуге болады: - вирусологиялық зерттеулер – зерттелетін заттан вирусты бөліп алып, содан соң идентификациялауға негізделген; - серологиялық зерттеу әдістері иммунологиялық реакцияларға негізделген. Вирустардың әсерінен организмде болатын спецификалық (арнайы) өзгерістерді анықтау, яғни қан сарысуындағы арнайы антиденелерді анықтау. - молекулалық-генетикалық зерттеулер - вирустың нуклеин қышқылын гибридизациялау немесе полимеразалық тізбектелу реакциясы көмегімен биологиялық материалдағы нуклеин қышқылдарының фрагменттерін табу. Вирусологиялық әдістердің негізі – қоздырушыларды зақымдалған материалдан бөліп алу. Ол үшін қоздырушыны арнайы тірі объектілерге егеді: лабораториялық жануарларға, тауық эмбриондарына, жасуша дақылдарында өсіріп-көбейтеді. Тәжірибеде біріншілік, жартылай ауыспалы (диплоидные или полуперевиваемые) және ауыспалы (перевиваемые) жасуша дақылдарын пайдаланады. Вирустарды жасуша дақылдары арқылы бөліп алу. Бұл өте арзан әдіс. Көп вирустардың түрін анықтау үшін (парагрипптің 3 серотүрін, аденовирустарды) жасушалар дақылдарын қолданады. Жасуша дақылдарында вирустың өсіп-көбею белгісі ретінде вирустың цитопагендік әсері болып табылады. Вирустар жасушаны өзгертеді: жасуша дөңгелектеніп зақымданады. Зақымданған жасуша еріп жоғалып кетеді. Оның орнына симпласт пайда болады. Вирустарды тауық эмбриондары арқылы бөліп алу. Эмбриондарды қолданғанда күндік жасымен (6-15 күндік) жұқтыру жолының маңызы бар. Сонымен бірге, тауық эмбриондарында жасырын вирустың бар-жоғын ескерту қажет. Себебі вирусы бар эмбрион ауруды дұрыс анықтауға кедергі жасайды немесе интерференция болуы мүмкін. Сондықтан, эмбриондарды таза құс фабрикасынан немесе оларды егілмеген тауықтардан алады. Вируспен зақымдалған материалды шприцпен хорион аллантоисты қабатына (ХАҚ), сарыуыз қапшығына, амнион және аллантоис қуыстарына енгізеді. Эмбриондарды горизонталды жағдайда термостатта (35-370 С) 48-72 сағат инкубациялайды. Тауық эмбрионында вирустар өсіп-өнген кезде ХАҚ-та тиісті өзгерістер пайда болады. Шешек вирустары ХАҚ-да түймешектер түзеді – диаметрі 1-3 мм ақшылдау дөңес дақтар. Вирусты бөліп алған соң оның түрін анықтау, яғни идентификация жүргізу үшін серологиялық реакциялар қолданады. Мысалы, гемагглютинациялық реакция (ГАР) – жұқтырылған эмбриондардың аллантоистық немесе амниондық сұйықтықтарында тауық немесе басқа жануарлардың эритроциттерінің гемагглютинациялануы орто- және парамиксовирустардың өсіп-өніп жиналғанын көрсетеді. Осындай вирустардың беткейлік құрылымдағы табиғаты гликлпротеидті гемагглютининдері эритроциттерді агглютинациялайды. Гемагглютинациялық реакция (ГАР) иммунологиялық реакцияға жатпайды, өйткені иммунды комплекс түзетін антиген мен антидененің өзара әрекеттесуі болмайды. Серологиялық әдістер көбінесе вирустың антигенімен гомологиялық антидененің өзара әрекеттесу реакцияларына негізделген. Мысалы, сұйық ортада - комплемент байланыстыру реакциясы (КБР-РСК); гельде - радиальды гемолиз реакциясы (РГР); ингредиенттердің біреуін тығыз негізге фиксациялау кезінде - иммунды флюоресценциялық реакция (ИФР), иммунды-ферментті талдау (ИФТ). Қазіргі кезде әр түрлі тәсілдермен таңбаланған АД немесе АГ қатысуымен қойылатын серологиялық реакциялар кең қолданылады. Мұндай реакциялар нәтижені жылдам алуға мүмкіндік береді және олардың сезімталдығы өте жоғары. Сондықтан, вирустық және бактериялық инфекциялар кезінде жылдам диагноз қою үшін жиі қолданылады. Таңбалаудың кең таралған тәсілдеріне жатады: 1) ультракүлгінмен сәулелендірген кезде флюоресценция беру қабілеттілігі бар флюохромдар және лантанйод тобына жататын металдар, мысалы флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ); осындай таңбалау ИФР-да пайдаланылады; 2) ферритин-ақуыз, құрамында 23%-ға дейін темір бар, ол жақсы контраст береді, сондықтан иммунды-электронды микроскопиялау кезінде таңбалау үшін қолданылады; 3) ферменттер-субстратпен өзара әрекеттескен кезде оны ыдыратып, боялған (хромогендік) өнімдер тұдырады, ИФТ-иммунды-ферментті талдау үшін пайдаланады; 4) радиактивті таңбалау, өте сезімтал РИТ-радиоиммунологиялық талдау реакцияларында қолданылады. Иммунды флуоресценциялық реакция (ИФР) – ИФР АД-мен химиялық байланысқан флюоресцеинизотиоцианатты немесе басқа флюорохромдарды пайдалануға негізделген. Бұл кезде таңбаланған АД иммунологиялық спкцификалығын сақтайды және тиісті корпускулярлы АГ-мен өзара әрекеттесуге түседі. Люминисцентты микроскопта препаратты зерттегенде жасыл-сары түспен жарқырап көрінуіне қарай АД мен АГ-кешенін оңай анықтауға болады. ИФР-ның екі түрі бар: төте (прямая) және жанама (непрямая). Молекулалық-генетикалық әдістер қоздырғыштың нуклеин қышқылының молекуласын табуға мүмкіндік береді. Олардың спецификалығы организм геномдарының, яғни ДНҚ және РНҚ-ң нуклеотидтік реттілігінің тек қана өзіне тән екендігімен байланысты және комплементарлық принципке – нуклеотидтік қосақтың (А-Т, Г-Ц) бір-біріне сәйкестігіне негізделген. Ол НҚ-ң ұқсас фрагменттерімен (соның ішінде эталондық және ізделетін фрагменттермен) гибридизациялауға мүмкіндік береді. Полимеразалық тізбектелу реакциясын (ПТР) қолдануға байланысты бұл әдіс жоғары сезімталдыққа ие болды. ПТР спецификалық праймерлердің (бұзғыш-затравка) – ерекше фермент полимеразалардың көмегімен ДНҚ-ң тиісті бір бөлігін циклдік қосақтауға негізделген. Бірінші циклден кейін ДНҚ-ң бір фрагментінен екі фрагмент пайда болады, екіншіден кейін – төртеу және әрі қарай ДНҚ-ң саны геометриялық прогрессиямен көбейеді. Ең соңында зерттелетін үлгіде (образец) НҚ-ң бір молекуласы болса да ДНҚ-ң саны жеткілікті мөлшерде жинақталады да, оларды физикалық-химиялық әдістермен – хроматографиямен немесе электрофорезбен оңай анықтауға болады. Қосақтану (амплификация) басталуы үшін қоздырғыш ДНҚ-ң тиісті учаскесіне комплементарлы 20-30 аминқышқылды қалдықтардан тұратын олигонуклеотидті реттілігі (праймер) болуы керек. Праймерлерді әртүрлі қоздырғыштардың белгілі гендеріне сәйкестігін сақтап, арнайы аппараттарда – синтезаторларда дайындайды. ДНҚ-ын бөлшектеу – секвенирлеу. Полимеразалық көшірмелеу принціпін пайдаланып, ДНҚ-ң бөлшектеу келесі кезеңдерден тұрады: 1) ПТР-дің көмегімен ДНҚ-ң зерттелетін учаскесінің көшірмелерін жеткілікті мөлшерде жинақтайды. 2) Алынған ДНҚ молекулаларын сілтілік гидролиздеумен ұзындығы әртүрлі фрагменттерге кесіп шығады. Мысалы, егерде ұзындығы 5 нуклеотидтен тұратын реттілікті зерттейтін болса, осы этаптан кейін ДНҚ кесіндісінің ұзындығы 1,2,3,4 және 5 нуклеотидтен тұратын қоспа алынады. 3) Алынған қоспаға дидезоксинуклеотидтерді (аденин, тимин, гуанин, цитозин) қосады. Олардың әрқайсысы өзіне тән бояғышпен белгіленеді. Таңбаланған дидезоксинуклеотидтер әрбір фрагменттің 3/ шетіндегі комплементарлы нуклеотидтерге тіркеледі. Тізбекшенің ұзаруы дидезоксинуклеотидтердің химиялық құрылысының ерекшеліктеріне байланысты осымен аяқталады. Сонымен, қандай нуклеотид олардың 3/ шетіне орналасуына байланысты ұзындығы әртүрлі фрагменттер өзіне тән әр түрлі таңбалармен белгіленіп қалады. 4) ДНҚ-ң таңбаланған фрагменттерінен алынған қоспа денатурациялануы вертикалды полиакриламидті гель арқылы электрофорезден өтеді. Бұл кезде бірінші кезекте молекулалық салмағы ең аз фрагмент (мысалы, ұзындығы 1 нуклеотидке тең ДНҚ-ң тізбекшелері) жылжиды. Олардың барлығы осы нуклеотидке сәйкес таңбаларды таситын болады – реттіліктегі бірінші нуклеотидке. Содан кейін оптикалық көрсеткіш (датчик) арқылы ұзындығы 2 нуклеотидтен тұратын ДНҚ тізбекшесі өтеді – оның шетіндегі таңба зерттелетін ДНҚ реттілігіндегі екінші нуклеотидке сәйкес келеді. Одан әрі ең ұзын фрагменттер өтіп болғанша процесс жалғаса береді. Электрофорез аяқталған кезде зерттелетін фрагментте нуклеотидтің реттілігі айқын анықталады.   Нуклеин қышқылдарын гибридизациялау. Гибридизация – ол бір тізбекшелі нысана – НҚ-ның радиоактивті изотоппен немесе ферментпен таңбаланған комплементарлы молекуласымен – зондпен байланысатын процесс. Зонд ретінде ДНҚ-н және РНҚ пайдалануға болады. ДНҚ зондтар екі тізбекшелі болатындықтан бір тізбекшелі фрагменттер алу үшін қолданудан бұрын оларды денатурациялау (мысалы, қыздыру) керек. РНҚ зондтар негізінде бір тізбекшелі молекулалар, қолданудан бұрын оларды денатурациялаудың қажеті жоқ. Зерттелетін материалда әдетте әр түрлі нуклеин қышқылдары кезедесетіндіктен, зонд ең алдымен осындай күрделі қоспадағы өзіне тән комплементарлы «серіктесін» тауып алып, содан кейін ғана онымен бірге кешен (комплекс) түзеді. Тәжірибеде гибридизацияның бірнеше модификациялары қолданылады.