II. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты, указав, что содержат, для чего и как применяются.

Педиатрия

ЗАНЯТИЕ 26

Тема: Микробиологическая диагностика туберкулеза.

Цель: На основе знаний биологии микобактерий туберкулеза, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемого ими заболевания.

Знать:

1. Классификацию и морфо-биологические особенности возбудителей туберкулеза.

2. Экологию, особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при туберкулезе.

3. Материал и методы микробиологической диагностики туберкулеза.

4. Специфическую профилактику и этиотропную терапию туберкулеза.

Уметь:

1. Готовить фиксированные препараты из мокроты, окрашивать их по методу Циля-Нильсена.

2. Обнаруживать микобактерии туберкулеза в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену.

3. Микроскопировать в люминесцентном микроскопе препараты из мокроты, окрашенные ауромином ОО, родамином С.

4. Определять чувствительность исследуемых культур микобактерий туберкулеза к антимикробным препаратам методом абсолютных концентраций.

Контрольные вопросы:

1. Современная эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Красноярском крае. Назовите причины сложившейся эпидемиологической обстановки.

2. Классификация и морфобиологические особенности возбудителей туберкулеза. Факторы патогенности возбудителей туберкулеза.

3. Источники инфекции, пути заражения, особенности патогенеза и иммунитета при туберкулезе.

4. Материал и методы микробиологической диагностики туберкулеза.

5. Специфическая профилактика и этиотропная терапия туберкулеза.

6. Современные аспекты лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести бактериологическое исследование мокроты обследуемого с клиническим диагнозом: «туберкулез легких», для чего:

1.1. Приготовить фиксированный препарат из мокроты обследуемого, окрасить по Цилю-Нильсену, промикроскопировать.

1.2. Промикроскопировать в люминесцентном микроскопе препарат из обогащенной мокроты того же обследуемого, окрашенный ауромином ОО, родамином С.

1.3. Охарактеризовать рост культуры на среде Левенштейна-Иенсена, выделенной из мокроты обследуемого.

1.4. Промикроскопировать препарат из чистой культуры, окрашенный по Цилю-Нильсену.

1.5. Учесть результаты посева культуры на среду с салициловым натрием.

1.6. Учесть и оценить результаты определения чувствительности исследуемой культуры к противотуберкулезным препаратам методом абсолютных концентраций.

На основе полученных данных сформулировать ответ, заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

2. Охарактеризовать биопрепараты: БЦЖ, БЦЖ-М, туберкулин и ознакомиться с тест-системой «Тубовид».

3. Контрольная работа: Воздушно-капельные инфекции (дифтерия, туберкулез, коклюш).

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Проведите бактериологическое исследование по обнаружению и выделению предполагаемого возбудителя из мокроты больного с подозрением на туберкулез легких, для чего:

На 1 этапе препарат из мокроты готовится следующим образом: чашку Петри с мокротой поместите на черную бумагу и препаровальными иглами отберите гнойные комочки, перенесите их на середину предметного стекла и покройте вторым стеклом так, чтобы осталась свободной треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два «препарата-близнеца», которые фиксируют в пламени.

Фиксированные препараты окрасьтепо методу Циля-Нильсена:

1. На препарат положите фильтровальную бумажку и с избытком налейте карболовый раствор фуксина Циля, который подогрейте до появления паров. При подогревании следите, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок оставьте на 5 минут.

2. Снимите бумажку и промойте препарат водой.

3. Обесцветьте препарат в 5% растворе Н₂SО₄ в течение 3 минут.

4. Тщательно промойте водой.

5. Докрасьте препарат 0,3 % водным раствором метиленового синего — 1 мин.

6. Промойте водой, высушите на открытом воздухе. Промокать препарат фильтровальной бумагой не надо.

Окрашенные мазки промикроскопируйте, просматривая не менее 100 полей зрения, чтобы обнаружить единичные микобактерии. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20-50 полей зрения.

Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза окрашиваются в ярко-красный цвет, в препарате из мокроты располагаются одиночно, парами или небольшими скоплениями. При этом единичные бактерии можно обнаружить, если в мокроте их содержание не менее 10⁵. Для повышения информативности микроскопии применяют методы обогащения - гомогенизация, флотация. Применение люминесцирующей микроскопии повышает число «находок» микобактерий туберкулеза. Микобактерии туберкулеза светятся ярким золотисто-желтым светом на темном фоне.

Обогащенную мокроту засевают на среду Левенштейна-Иенсена и инкубируют при 37°С 2-3 недели и более, т.к. микобактерии туберкулеза медленно размножаются.

На 2 этапе оцените результаты роста на среде Левенштейна-Иенсена культуры, выделенной из мокроты больного. Промикроскопируйте готовый мазок из этой же культуры (окраска по Цилю-Нильсену). Сделайте вывод.

Микобактерии туберкулеза образуют морщинистые, цвета слоновой кости колонии, плотно сросшиеся с питательной средой. В препарате выявляют характерные кислотоустойчивые (окрашенные в красный цвет) палочки, расположенные скоплениями и поодиночке.

Для идентификации культуры производят определение биохимических свойств (ниациновая проба, восстановление нитратов и др.), способности расти на среде с салициловым натрием, антигенных свойств (ИФА с использованием моноклональных антител с помощью системы «Тубовид»).

С целью рациональной терапии важно определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам, которое проводится методом абсолютных концентраций. Для этого в среду Левенштейна-Иенсена перед свертыванием добавляют противотуберкулезные препараты. Интенсивность роста оценивается плюсами:

++++ - сплошной, сливной рост; +++ - более 100 колоний; ++ - от 50 до 100 колоний;

+ - от 20-50 колоний; ЕК - единичные колонии.

Культуру считают чувствительной к препарату, если выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке и устойчивой, если выросло более 20 колоний.

На 3 этапе учтите результаты посева культуры на среду с салициловым натрием, дайте оценку чувствительности выделенной культуры к противотуберкулезным препаратам и по ре­зультатам всех этапов исследования сформулируйте окончательный ответ, заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

II. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты, указав, что содержат, для чего и как применяются.

III. При подготовке к контрольной работе по теме «Воздушно-капельные инфекции (дифтерия, туберкулез, коклюш)» рекомендуется придерживаться следующего плана:

1. Таксономия возбудителя: для бактерий - семейство, род, вид.

2. Характеристика бактериального возбудителя: морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, антигенные свойства, факторы патогенности, резистентность к различным факторам.

3. Вызываемые заболевания: экология, краткая эпидемиологическая характеристика (источники инфекции, механизмы, пути и факторы передачи, восприимчивый коллектив), патогенез, основные клинические проявления, особенности иммунитета.

4. Микробиологическая диагностика: исследуемый материал, применяемые методы диагностики; их обоснование.

5. Специфическая профилактика и терапия (вакцины, сыворотки).

Вопросы для самоконтроля:

1. Назовите виды микобактерий, вызывающих туберкулез человека. Какой вид является основным?

2. Назовите биологические особенности микобактерий, связанные с высоким содержанием в них липидов и их патогенетическое значение.

3. Назовите факторы патогенности возбудителей туберкулеза и механизм их действия.

4. Обоснуйте возможности использовании при микробиологической диагностике туберкулеза:

- микроскопического метода;

- бактериологического метода;

- серологического метода;

- аллергического метода.

5. Каковы объективные причины длительности бактериологической диагностики при туберкулезе.

6. Назовите методы микробиологической диагностики с помощью которых можно выбрать препараты для этиотропного лечения туберкулеза?

7. Назовите метод микробиологической диагностики для выявления туберкулеза у детей и подростков. Обоснуйте.

8. Назовите метод экспресс-диагностики туберкулеза, который позволяет определить наличие микобактерий туберкулеза в исследуемом материале и их резистентность к противотуберкулезным препаратам. В чем его суть?

9. Что такое множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) микобактерий туберкулеза и каково значение её определения?

10. Что такое первичная лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза и каково значение её определения?

11. Что такое приобретенная (вторичная) лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза и каково значение её определения?

12. Что такое полирезистентность микобактерий туберкулеза?

Литература:

Учебники:

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 436-441.

2. Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – С. 499-516.

3. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 406-413; 2004. – С. 406-411.

Лекции по микробиологии.

Тесты.