Качественное обнаружение аминокислот в моче
Лабораторная работа № 8
Переваривание белков пепсином.
Переваривание белков начинается в желудке под влиянием желудочного сока. Желудочный сок, выделяемый железами слизистой оболочки стенок желудка, содержит 99% воды, свободную хлороводородную кислоту, фосфаты, хлористый натрий, протеолитический фермент – пепсин и другие вещества. Пепсин выделяется главными клетками желез слизистой желудка в виде неактивного профермента – пепсиногена. Под влиянием хлороводородной кислоты от пепсиногена отщепляются полипептиды, в результате чего пепсиноген превращается в активный фермент пепсин, способный к гидролитическому расщеплению пептидных связей белков. Оптимальное значение РН для пепсина человека 1,5–2,5. В нейтральной и щелочной среде пепсин неактивен. Хлороводородная кислота не только участвует в активации пепсиногена и созданию оптимального значения РН, но и способствует набуханию и денатурации белков, что создает более благоприятные условия для действия пепсина. Пепсин является эндопептидазой и действует преимущественно на внутренние пептидные связи. В результате гидролиза белков пепсином образуются пептоны – смесь более или менее сложных полипептидов, а также в небольшом количестве свободные аминокислоты.
Реактивы:
1.Фибрин.
2.Желудочный сок или пепсин.
3.Гидрокарбонат натрия, 2% раствор.
4.Гидроксид натрия, 0,4% раствор.
5.Хлороводородная кислота, 0,2% раствор.
6.Гидроксид натрия, 10% раствор.
7.Сернокислая медь, 1% раствор.
Ход работы. В одну пробирку наливают 1 мл желудочного сока, во вторую – 1 мл желудочного сока, нейтрализованного раствором гидрокарбоната натрия, в третью – 1 мл желудочного сока, предварительно подщелоченного 0,45 раствором гидроксида натрия, в четвертую – 1 мл желудочного сока, предварительно подвергнутого кипячению, в пятую пробирку отмеривают 1 мл 0,2% раствора хлороводородной кислоты. Во все пять пробирок добавляют одинаковые небольшие кусочки фибрина, и пробирки помещают в термостат при 38-400 С. После переваривания фибрина в первой пробирке (примерно через 30 минут от начала опыта) все пробирки вынимают из термостата и наблюдают за изменениями фибрина. Переваривание фибрина в первой пробирке указывает на то, что пепсин действует в присутствии хлороводородной кислоты. Фибрин во второй и третьей пробирках остается неизменным, так как пепсин в нейтральной и щелочной среде неактивен. В четвертой пробирке, где фермент был инактивирован кипячением, и в пятой пробирке, в которой пепсина не было, может произойти лишь набухание фибрина под влиянием хлороводородной кислоты.
Содержимое каждой пробирки фильтруют и с фильтратом производят биуретовую реакцию. Положительная реакция обнаруживается только в первой пробе, где был актив- ный желудочный сок и фибрин, что указывает на присутствие в фильтрате продуктов пере варивания белка.
Оформление работы. Результаты наблюдений занести в таблицу
| № проб | Фер- мент | Суб- страт | Реакция среды | Инактивация пепсина кипячением | Видимые изменения фибрина | Биуретовая реакция |
В соответствии с полученными данными указать оптимальные условия для переваривания белка пепсином и роль хлороводородной кислоты в этом процессе.
Качественное обнаружение аминокислот в моче
Принцип работы. Качественная реакция для обнаружения аминокислот в моче основана на том, что нингидрин дает с аминокислотами синее или фиолетовое окрашивание, но если аминокислоты связаны в хелатные комплексы, то они не реагируют с нингидрином. Для определения в моче аминокислот их следует вытеснить из хелатных комплексов путем добавления комплексона, обладающего более высоким сродством к катионам, чем аминокислоты. Обычно в качестве такого комплексона пользуются двунатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Освободившиеся аминокислоты реагируют с нингидрином.
Реактивы:
1.Моча.
2.Нингидрин, 0,2% раствор в спирте, насыщенном ЭДТА.
Ход работы. К 10 каплям мочи добавляют 10 капель предварительно взболтанного 0,2% раствора нингидрина в спирте, насыщенном ЭДТА. Содержимое пробирки нагревабт и наблюдают появление синего окрашивания, обусловленного образованием продукта взаимодействия аминокислот с нингидрином.