Замораживание патогенных простейших

Первые исследования по сохранению простейших в замороженном состоянии носили
чисто познавательный характер. В настоящее время интерес к этому вопросу объясняется
возможностью практического использования патогенных простейших для
приготовления диагностических препаратов, а также изучением условий, способствующих
освобождению от них препаратов крови и спермы сельскохозяйственных животных,
предназначенной для искусственного осеменения. Еще в 1939 г., то есть задолго до того, как
была разработана методика сохранения эритроцитов в замороженном состоянии,
Коголла сообщил о сохранении малярийного плазмодия (623) в крови обезьян,
хранившейся в течение 19-70 дней в замороженном состоянии при температуре -76°.
Размороженная при 37,5° кровь вызывала заболевание после внутривенного введения ее
обезьянам макакам-резусам. Несмотря на то, что в процессе замораживания при
указанных условиях сохранялось незначительное количество неразрушенных эритроцитов,
инфекционность такой крови практически не отличалась от свежей крови.

В дальнейшем было установлено, что в процессе замораживания крови при -55-78
могут сохраняться плазмодии птиц (554, 871, 872, 873, 874). В замороженной до -75° крови
простейшие сохранялись в течение 244 дней. Уолфсон (1148) показала, что степень
инфекционности крови птиц не изменялась на протяжении от двух дней до одного года ее
хранения при 75°. Однако необходимо отметить, что степень сохранения плазмодиев
исследователи определяли только качественной пробой инфицирования животных, поэтому
трудно судить об их количественном сохранении в замороженном состоянии. При
количественном определении выживаемости Leishmania tropicca и Leishmania donovani
Уэнмен и Мак Аллистер (1140) нашли, что после замораживания при -70° и последующего
оттаивания указанные микроорганизмы погибали. Частично сохранялись лейшмании в
пробах крови, замороженных при -15 и хранившихся при -70° от 5 до 407 дней.

Хорошие результаты медленного замораживания простейших в опытах указанных
автором объясняются тем, что жизненный цикл этих паразитов не связан с пребыванием в
эритроцитах. Левадити (834) установил, что выживаемость простейших в крови связана со степенью сохранения целостности замороженных эритроцитов. Поэтому все простейшие,
паразитирующие в эритроцитах, более длительно сохраняют жизнеспособность в условиях,
оптимальных для сохранения эритроцитов, то есть после введения в среду 15-25%
глицерина либо других защитных сред (маннитол, диметилсульфоксид).

Однако не все простейшие сохраняют жизнеспособность при замораживании даже в
присутствии глицерина, что объясняется токсическим действием его при увеличении
концентрации в процессе замораживания. Так, при замораживании в присутствии 5%
глицерина Amoeda proteus утрачивала жизнеспособность, хотя и не отмечалось видимых
изменений структуры указанного микроорганизма. Повышенные концентрации глицерина
токсически действовали на Amoeda proteus и при положительных температурах (1064).
Более устойчивой к замораживанию в присутствии глицерина оказалась кишечная амеба
(Entamoeda histolytica), адаптированная к высокому осмотическому давлению в прямой
кишке (697). По устойчивости к замораживанию этот вид простейших весьма близок к
эритроцитам, сперматозоидам и изолированным клеткам животных. Жизнеспособные
амебы сохраняются при условии медленного (1° в минуту) охлаждения их от 4 до -15° и
дальнейшего понижения температуры до -79° со скоростью 5° в минуту. Амебы,
охлаждавшиеся быстро от 4 до -79° или от -15 до -79°, теряли жизнеспособность. Поэтому
Entamoeda histolytica может служить моделью для изучения влияния замораживания на
животные клетки.

Защитное действие этиленгликоля изучалось при замораживании Physarella oblonga,
простейшего, относящегося к типу Мусеtozoa и имеющего стадию амебы и зооспоры (700).
При этом было установлено, что часть организмов сохранилась в процессе замораживания и
оттаивания. Судя по одному опыту, описанному Шарфом (1031), этиленгликоль оказывает
некоторое токсическое действие на Physarella oblonga. Быстрое замораживание
микроорганизма до -195° после добавления 1М этиленгликоля способствовало сохранению
до 70% живых клеток, а выдерживание до 5 минут в этой же среде перед замораживанием
снижало число жизнеспособных, клеток после замораживания и оттаивания до 25%.

Значительное число исследований по влиянию замораживания на простейшие проведено
со жгутиковыми микроорганизмами, относящимися к роду трихомонад и. трипанозом.
Известно, что трихомонады весьма чувствительны к низким температурам и обычно ут-
рачивается полностью или значительная часть жизнеспособных клеток в процессе
замораживания и оттаивания (1140). Введение от 0,5 до 10% глицерина в среду
предохраняло Nrichomonas vaginalis, Т. gallinae и Т. hominis от гибели не менее 12 месяцев
при условии медленного замораживания до -79° и последующего хранения при этой
температуре (881). В то же время возбудитель трихомоноза крупного рогатого скота (Т.foetus), несмотря на близкую родственность к указанным выше видам трихомонад, оказался
весьма чувствительным к замораживанию, полностью утрачивая жизнеспособность, как при
быстром, так и при медленном замораживании. Исходя из этого, Джойнер (790, 791)
высказал предположение, которое в дальнейшем экспериментально обосновал, что
замораживание спермы с 10 и 7,5% глицерина по методу Польджа приводит к потере
жизнеспособности Т.foetus и освобождает сперму от этого опасного простейшего-паразита.
Однако данные Джойнера не были полностью подтверждены. Только единичные сообщения
указывали на потерю жизнеспособности Т.foetus при замораживании спермы быка (566).
Большинство же исследователей после замораживания инфицированной спермы быка
находили жизнеспособные трихомонады (585, 835, 882).

В среде ЦППМ, состоящей из цистеина, пептина, вытяжки из печени и мальтозы с 1М
глицерина, трихомонады переносили медленное замораживание до -20° и -70°, но погибали
в процессе хранения при этих температурах (836). Выживаемость трихомонад возрастала,
когда их перед замораживанием выдерживали в среде с глицерином не при 4°, а при 24° и
при использовании для забуферевания среды не фосфатов, а глицилглицина и
триэтаноламина (683).

Заметно влиял на сохраняемость трихомонад в замороженном состоянии также возраст
культур. Оптимальным возрастом культур для хранения в замороженном состоянии в
течение 10-15 дней является 32,3 часа культивирования при 37°. Существенно влияла на
жизнеспособность трихомонад концентрация хлористого натрия. В тех случаях, когда
глицерин перед добавлением к среде ЦППМ разводили не на физиологическом растворе
ЫаС1, а на дистиллированной воде, выживаемость трихомонад при замораживании и
хранении при температуре -21° возрастала более чем на 30% (837). Впервые 7-8 дней
хранения в замороженном состоянии не отмечается разницы в сохраняемости трихомонад
при температуре -28° и -95°. Начиная с 16-го дня хранения количество жизнеспособных
трихомонад при -28° заметно уменьшается, а при -95° стабильно сохраняется (838).

Таким образом, для сохранения Т.foetus в замороженном состоянии необходимо
использовать 32-37-часовые культуры. Среда ЦППМ в смеси с 10% глицерина надежно
предохраняет трихомонады при замораживании. Раствор глицерина необходимо готовить на
дистиллированной воде. После добавления глицерина к среде с трихомонадами ее
необходимо выдержать при 24° в течение 12-24 часов. Замораживать необходимо медленно,
со скоростью не более 1 в минуту при охлаждении до -20° и не более 2-3° в минуту при
дальнейшем понижении температуры. При хранении трихомонад в замороженном
состоянии рекомендуется избегать колебаний температуры. Размораживать среды,
содержащие трихомонады, следует быстро, погружая сосуды в водяную баню с
температурой воды 35-38°.

К числу простейших, консервирование которых представляет практический интерес,
следует отнести также трипаносомы. Этот вид простейших, относящийся к классу
Mastegophora, к отряду Binucleata, сравнительно устойчив к замораживанию. Отдельные
клетки трипанозом сохраняют жизнеспособность при быстром и медленном замораживании
без добавления к крови глицерина. Для сохранения трипансом в среде без глицерина
необходимо быстро замораживать до -79°, а в среде, содержащей 5 или 10% глицерина,
микроорганизмы выживают при медленном замораживании (961, 962).

Губительно влияет на выживаемость трипаносом присутствие в среде хлористого
натрия, поэтому их целесообразнее суспендировать в дистиллированной воде, содержащей
глюкозу, ксилозу или сахарозу.

Практически для замораживания трипаносом рекомендуются следующие условия.
Содержащий трипаносомы материал суспендируют в 10%-ном растворе нормальной
лошадиной сыворотки или 7,510%-ном растворе сахарозы на дистиллированной воде.
Можно также использовать растворы, содержащие 7,5% глюкозы, 10% ксилозы или 15%
сахарозы, приготовленные на дистиллированной воде. Указанные растворы можно
использовать без глицерина или с добавлением его от 5 до 10%. Глицерин в более высоких
концентрациях (15-20%) также не отказывает на трипаносомы токсического действия.
Замораживают трипаносомы в среде с глицерином медленно, со скоростью не более 2° в
минуту. Лучшие результаты получают при двухэтапном замораживании: вначале
замораживают при -20 или -30° и выдерживают при этой температуре 2-5 минут, а затем
быстро охлаждают до -79°. Оттаивают препараты быстро, погружая в водяную баню,
подогретую до 35-37°. Продолжительность сохранения трипаносом при -79° не менее 2 лет;
количество жизнеспособных клеток при этом составляет около 80%.

В отличие от трипаносом токсоплазмы более чувствительны к замораживанию и не
переносят охлаждения до -40° и ниже в средах без глицерина (874). Жизнеспособность
токсоплазм лучше сохраняется при замораживании их в физиологическом растворе хло-
ристого натрия, содержащем от 5 до 10% глицерина. Замораживают токсоплазмы до -79° в
указанном растворе крайне медленно, 6 часов и дольше. При таких условиях токсоплазмы
выживают более длительно. Оттаивают токсоплазмы в водяной бане, подогретой до 35-40°.
Продолжительность хранения при -79° более года (670).