Необходимые приборы и реактивы

• ДНК-амплификатор(термоциклер) – прибор, обеспечивающий циклическую смену температур по заданной программе (выпускаемые в настоящее время термоциклеры рассчитаны на одновременное проведение до 96 реакций);

• стандартный наборлабораторного оборудования для выделения генетического материала из исследуемых образцов, постановки электрофореза (центрифуга типа "Eppendorf), вортекс, автоматические пипетки, источник питания, электрофоретические камеры, трансиллюминатор), одноразовые наконечники и пробирки для ПЦР;

• термостабильная ДНК-полимераза,выдерживающая многократный нагрев до 96 ⁰C; это фермент, выделяемый из бактерий, обитающих в горячих источниках (гейзерах). В настоящее время известны два штамма термофильных бактерий, из которых выделены эти ферменты (Termus aquaticus и Termus thermophilus), соответственно ферменты обозначаются Taq-полимераза и Tth-полимераза.

• Праймер– олигонуклеотид из 15-20 нуклеотидов, является затравкой для синтеза новой молекулы ДНК. Данный олигонуклеотид должен быть специфичным для исследуемого организма (возбудителя болезни). Его получают путем химического синтеза на автоматическом синтезаторе, пользуясь данными о первичной структуре (нуклеотидной последовательности) ДНК.

• дезоксинуклеозидтрифосфаты – dNTP, предшественники синтеза ДНК.

В настоящее время выпускаются специальные наборы для ПЦР, предназначенные для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, бруцеллеза, ящура и других инфекционных болезней животных. Обычно один набор содержит компоненты для анализа 100 образцов. На рис. 12.7 показаны результаты проведения полимеразной цепной реакции по идентификации классической чумы свиней.

Рис. 12.7. Фотография электрофореграммы, полученной при ультрафиолетовом (УФ) освещении агарозногогеля с продуктами ПЦР. Полосы, выявляемые при УФ-освещении, – это фрагменты ДНК, амплифицированые с участием использованных в опытах праймеров. Контроль – лизат из культуры клток ПК-15, КЧС – лизат из клеток, инфицированных вирусом классической чумы свиней.

ОБМЕН ВОДЫ И СОЛЕЙ

Организм животных и растений, кроме белков, углеводов и липидов, содержит обширную группу веществ неорганической природы. К ним относятся вода, анионы и катионы неорганических кислот и солей. Значительная часть солей в организме находится в растворенном состоянии. Другая часть образует прочные нерастворимые комплексы с белками, например, фосфорнокислый кальций в костной ткани, углекислый кальций в раковинах моллюсков. Некоторое количество минеральных веществ входит в состав органических веществ: железо содержится в геме гемоглобина, цитохромов, каталазы, миоглобина; магний, марганец, цинк, медь – в ряде ферментов; йод – в тироксине; кобальт – в витамине B₁₂. Сейчас установлено, что в организме животных и растений обнаруживается до 76 различных элементов (из известных 106).

Различают макроэлементы – их содержание в тканях составляет мг% и более: Ca²⁺, Mg²⁺, Na⁺, K⁺, P⁵⁺, Сl^- , S^2-.

Микроэлементы – в следовых количествах (мкг%, 10^-3 и менее) –Fe²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, I^-, Mo²⁺, Co²⁺ и др. – однако в некоторых органах они могут содержаться в значительных количествах, например, йод в щитовидной железе.

Вода, ее содержание и роль в организме

Вода составляет 75% биомассы Земли, 65% общей массы животного организма. Вода обеспечивает всасывание, механическое передвижение питательных веществ, продуктов обмена, является универсальным растворителем. Участвует в процессах набухания, осмоса, создает онкотическое добавление в крови, тканях. Для воды характерна высокая удельная теплоемкость, теплопроводность; она обеспечивает поддержание температуры тела. Вода высокополярное соединение, вызывает диссоциацию электролитов, обуславливает гидратацию, участвует в гидролитическом распаде, вода сама является конечным продуктом обмена в процессе биологического окисления.

Все основные химические реакции в клетке – биосинтез, ферментативный катализ происходят с участием воды. Молекула воды – электрический диполь, дипольный момент 1,86. Для молекул воды характерна водородная связь, определяющая в значительной степени ее свойства и значение. Водородные связи возникают между частичным отрицательным зарядом атома кислорода одной молекулы воды и частичным положительным зарядом атома водорода соседней. Каждая молекула воды связана с четырьмя молекулами H₂O, образуя сетку водородных связей ( рис. 13.1.).

Рис. 13.1. Образование сетки водородных связей.

При внешних воздействиях сетка водородных связей перестраивается (растворение различных веществ, образование пара, льда), этим определяется ряд свойств воды. Между молекулами воды имеются пустоты, которые могут заполняться частицами растворенного вещества. Это очень важное свойство воды как растворителя. Так, в одном литре воды лишь 370 мл занято ее молекулами, а 630 мл составляет межмолекулярное пространство, где протекают различные процессы в ходе растворения, диффузии, гидролитического расщепления.

Для воды характерна очень низкая вязкость, что придает водным растворам хорошую текучесть и быстрое перемещение жидкостей.

В организме вода находится в свободном и связанном (иммобилизованном) виде. Свободная вода содержится в плазме крови, лимфе, спинномозговой жидкости, в пищеварительных соках, моче. В межклеточном пространстве свободной воды мало, она там удерживается капиллярными силами. Свободная вода обеспечивает приток к тканям питательных веществ и удаление из них конечных продуктов обмена.

Связанная вода не способна к свободному перемещению. Часть воды связана с белками (с полярными группами) – это гидратационная вода. Каждые 100 г белка могут связывать 18-20 г воды. На 1 молекулу нуклеиновой кислоты приходится 100000 молекул воды, белка – 40000 и липидов – 1500 молекул воды. Гидратационная вода не замерзает при охлаждении до O^о C и ниже, имеет повышенную плотность (1,48-2,4), в ней не растворяются вещества, обычно растворимые в воде. Эти отличия обусловлены упорядоченным расположением молекул (диполей) воды вокруг полярных групп гидрофильных коллоидов.

Часть иммобилизованной воды находится в надмолекулярных клеточных структурах (мембраны, органеллы, фибриллярные агрегаты). Такая вода сохраняет способность растворять соли и растворимые вещества, обеспечивает высокую скорость химических реакций в тканях, способствует сохранению постоянной формы этих органелл. Так, от степени набухания митохондрий зависит интенсивность окислительногфосфорилирования, от насыщения рибосом водой – скорость белкового синтеза (до 80-90%).

Количество гидратационной воды в организме с возрастом снижается, как результат снижения у коллоидов способности к гидратации. Коллоиды цитоплазмы постепенно подвергаются синерезису, вследствие этого ткани теряют упругость, сморщиваются.

Животные лишенные воды погибают быстро. Например, хорошо упитанная собака может выдержать голодание в течение 100 дней, а без воды – погибает через 10 дней. Животное может жить при полном отсутствии запасов жира и потере до 50% белков, но потеря 10% воды вызывает тяжелые изменения, а потеря 15-20% воды – влечет за собой смерть. Потребность в воде и распределение ее в тканях изменяется в зависимости от состава корма, физиологического состояния, продуктивности и т.д. Животные в пустыне могут обходиться без воды довольно долго, за счет эндогенной воды. При окислении 1 г углеводов образуется 0,55 г воды; 1 г белков – 0,41 г воды; 1 г жиров – 1,07 г воды.

Среди представителей низшего животного и растительного мира есть формы, которые могут продолжительное время оставаться без воды и далее высыхать. При этом они не погибают, а переходят в состояние анабиоза. В случае повышения влажности внешней среды они вновь возвращаются к активной жизни. К таким формам относятся черви коловратки, бактерии, некоторые насекомые, лишайники.

Потребность животных в воде удовлетворяется в основном за счет поступления ее извне непосредственно и при поедании сочных кормов. Организм коровы, например, за сутки принимает 40-50 л воды, кроме этого в желудочно-кишечный тракт в составе кишечных соков выделяется еще 120-130 л воды, из этого количества лишь 10% выделяется с калом, а остальная часть обратно всасывается в кровь. Вода постоянно теряется из организма с мочой, потом, секретами (молоко), с выдыхаемым воздухом.

Регуляция водного обмена осуществляется центральной нервной системой, действием некоторых гормонов. Например, вазопрессин нейрогипофиза (антидиуретический гормон) способствует реадсорбции из первичной мочи воды; альдостерон (гормон коры надпочечников) способствует задержанию натрия в организме, тем самым удержанию воды в организме, т.к. катионы натрия повышают гидратацию тканей.

Количество воды в тканях повышается при заболеваниях почек, нарушении сердечно-сосудистой системы, при белковом голодании, при циррозе печени. Увеличение задержания воды в межклеточном пространстве приводит к отекам.

Электролиты тканей. Обмен воды тесно связан с обменом электролитов. Значение минеральных солей в питании животных и человека изучено достаточно подробно. Животные получают минеральные вещества в составе кормов и питьевой воды. Поэтому имеется прямая связь минерального питания с окружающей средой. Почти все элементы земной коры встречаются в составе растений и животных тканях. Недостаточность или избыточное содержание отдельных элементов в окружающей среде, и как результат – в кормах – приводит к различным нарушениям (учение В.И. Вернадского, А.П. Виноградова, Я.В. Пейве, В.В. Ковальского и др.). Проблемы биогеохимии изучались особенно интенсивно в последние десятилетия. Отдельные области земли отличаются между собой химическим составом почв и природных вод – в них может быть повышенное или пониженное содержание отдельных химических элементов. На этой почве у животных и человека развиваются эндемические заболевания (endemos – местный). В нашей стране изучены эндемические районы по зобу из-за недостатка йода. В районах Нечерноземья РФ описано пониженное содержания кобальта, йода, меди как результат – акобальтозы, авитаминоз В_!2, анемия, эндемический зоб. Между отдельными элементами при их действии на организм существует антагонизм, например, между Ca²⁺ и Zn²⁺; Zn²⁺ и Cu²⁺; Cu²⁺ и Mo²⁺; Mo²⁺ и S²⁺; Co²⁺ и Mn²⁺ и т.д. Нарушение минерального обмена у животных отмечается в связи с загрязнением окружающей среды, интенсивной технологией земледелия.

Ионы металлов в организме рассматриваются в качестве «комплексообразователей». Они в таком виде находятся в составе ферментов, известно свыше 300 ферментов, содержащих в своем составе металлы. В одних случаях металлоферменты с прочной связью с металлом (истинные), в других случаях металлы связаны непрочно.

«Истинные металлоферменты» участвуют в окислительно-восстановительных процессах организма. В активные центры этих ферментов, как правило, входят строго определенные катионы, которые не удается заменить другими. В составе истинных металлоферментов чаще всего находятся медь, молибден, цинк (Cu²⁺, Mo²⁺, Zn²⁺).

В ферментах, где металл с апоферментом связан непрочно, минеральный компонент не представляет строгой специфичности и может заменяться другими близкими по химическим свойствам металлами.

Биологическая активность элементов в организме во многом зависит от их атомного строения: с нарастанием атомной массы, как правило, увеличивается токсичность элементов, уменьшается их процентное содержание.

В организме всего 2-3% минеральных веществ, но они распределяются неравномерно. Натрий – содержится в больших количествах в различных жидкостях организма. Калий – внутри клеток, кальций, магний, фтор – в костной ткани.

Минеральные вещества усваиваются в основном в тонком отделе кишечника, а некоторые ионы всасываются уже в желудке, а также в толстом отделе кишечника. Всасывание их – активный, контролируемый, сложный процесс. После всасывания солей, их ионы откладываются избирательно.

Кальций, магний, фтор, стронций, цезий, рубидий, бериллий, алюминий, свинец, олово, титан откладываются в костной ткани. Натрий, калий – в мышцах, коже. Железо, медь, кобальт, марганец, никель, молибден, селен и др. – накапливаются в печени.

Основное значение минеральных веществ – это регуляция физико-химических процессов в тканях организма. Они принимают участие в формировании третичной и четвертичной структуры биополимеров, что обеспечивает нормальное функционирование ферментативной активности, гормональной активности, реализации генетической информации, заложенной в нуклеиновых кислотах, формирование надмолекулярных структур клеточных образований. Например, активная форма инсулина образуется с ионами цинка; биологическая активность рибонуклеиновых кислот проявляется с участием ионов цинка, марганца, никеля; ассоциация и диссоциация рибосом на 60 S и 40 S субчастицы, образование третичной структуры транспортных рибонуклеиновых кислот связана с ионами магния, окислительное фосфорилирование в митохондриях и свободное окисление происходит с участием ионов железа и меди.

Минеральные вещества принимают участие в ферментативном катализе. Многие ферменты проявляют активность при участии ионов металлов. Часто связь иона металла непрочная, т.е. ион металла является кофактором. В виде комплекса с металлом фермент проявляет максимальную активность, приобретая соответственную пространственную конфигурацию: ион металла участвует в образовании третичной и четвертичной структуры белков и нуклеиновых кислот. Известно около 100 ферментов, активность которых обуславливается ионами Na⁺, K⁺, Сl^-, Zn²⁺, ферменты мультимеры образуются с участием ионов металлов Mg⁺, Mn ⁺, Zn ⁺, Ca²⁺ и др.

В ряде случаев ионы металлов прочно соединены с ферментами, т.е. являются коферментами. К ним относятся ферменты-металлопротеины, содержащие ионы Cu²⁺, Fe²⁺ – железосерные белки, цитохромы и т.д.

Минеральные вещества имеют тесную связь с обменом нуклеиновых кислот. Так вторичная и третичная структура ДНК и РНК поддерживается ионами Fe²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺,Co²⁺. Ферменты ускоряющие распад и синтез нуклеиновых кислот, нуклеотидов, нуклеозидов, пуринов, пиримидинов, активируются ионами металлов, где особенно важную роль играют ионы магния. Важную роль играют металлы в обмене белков, липидов, углеводов.