Структура молекул IL-1F и важнейшие молекулярные детерминанты рецепции

Введение

Сложность организации многоклеточных животных влечет за собой очевидную необходимость наличия систем, отвечающих за интеграцию органов, тканей и, наконец, клеток этого организма. Классическая точка зрения выделяет два крупных уровня этой интегрирующей системы: нервная регуляция и гуморальная. Обе эти системы находятся в постоянном взаимодействии и устроены таким образом, чтобы координировать состояние и функции организма, исходя из состояния внешней и внутренней среды. Подробности строения и функционирования этих систем подробно рассматриваются в пределах многих общих и специальных курсов университетского образования. Однако, существует точка зрения, что цитокиновая регуляция, координирующая функционирование организма на клеточном и тканевом уровнях, может являться третьим уровнем организации этой интегрирующей системы. И нервная и гуморальная и цитокиновая регуляции координируют и дополняют друг друга.

Цитокины – это разнообразный класс белковых медиаторов межклеточных взаимодействий. Цитокинами регулируются очень многие функции организма, от процессов роста и развития, до иммунитета, регенерации и поведения. Цитокиновая регуляция имеет несколько отличающих её функциональных характеристик. В первую очередь, это продукция цитокинов отдельными клетками, а не органами или железами, плейотропность действия одного и того же цитокина на разные типы клеток, наличие большого количества функциональных дублеров с перекрытием функций разных цитокинов, групповое воздействие на клетки, когда на клетку воздействуют сразу несколько цитокинов, при этом результирующее действие такой “смеси” медиаторов не равно простой сумме их биологических активностей. Все эти особенность приводят к появлению так называемой цитокиновой сети – многоуровневой нецентрализованной системы регуляции. Учитывая значение цитокинов в регуляции функций организма, очевидно, что нарушения функционирования этой физиологической системы влекут за собой многочисленные и разнообразные патологии. Таким образом, изучение закономерностей устройства цитокиновой системы регуляции – это возможность обнаружить причины патологий и определить молекулярные мишени для их лечения.

Одной из крупных групп цитокинов является семейство интерлейкина-1. Данная работа посвящена разбору информации об этом важнейшем семействе.

Семейство интерлейкина-1

Семейство IL-1 (IL-1F) на данный момент объединяет 11 структурно близких молекул–медиаторов воспаления. Представители этого семейства имеют общее эволюционной происхождение. Причем, молекулярный предок всех современных представителей этой группы появился в результате дупликации гена, вторая копия которого в дальнейшем дала начало группе факторов роста фибробластов. [37] Это является причиной высокой структурной гомологии FGF и IL-1. Члены семейства связаны с регуляцией реакций врожденного иммунитета. Особенности функционирования членов IL-1F связаны, прежде всего, с высокой гомологичностью внутриклеточных доменов их рецепторов с внутриклеточными доменами Toll-like рецепторов (TLR). Эти домены получили общее название TIR-домены (Toll-like and Interleukin-1 Receptor). [23] Сходство структуры, биохимии и адаптерных молекул, а значит, и сигнальных эффектов внеклеточных лигандов TLR и рецепторов IL-1RF имеет важное следствие: для клеток их действие очень похоже. Дублирование эффектов PAMPs членами IL-1F необходимо для амплификации сигнала от патогенов без их диссеминации, и генерализации местных эффектов воспаления, то есть достаточно большое локальное воспаление может иметь эффекты на системном уровне [1]. Важная черта, отличающая функционирование систем IL-1F как от системы лигандов TLR, так и от других групп цитокинов – это существование кроме активирующих молекул-агонистов, еще и рецепторных антагонистов-дезактиваторов, способных регулировать распространение и силу влияний агонистов IL-1F. Так, IL-1α и IL-1β имеют специфический рецепторный антагонист IL-1Ra. Благодаря его экспрессии в ответ на IL-1 и коэкспрессии вместе с IL-1, возникает активная система сдержек, то есть отрицательная обратная связь, которая помогает контролировать воспалительные реакции, опосредованные IL-1. Часто причиной воспалительных заболеваний является именно нехватка или мутации в структуре рецепторного антагониста [75].

Рецепторы семейства IL-1

Свои биологические функции межклеточной кооперации представители семейства IL-1 осущеcтвляют посредством связывания с рецепторами на клеточной мембране клеток-мишеней. В группу рецепторных молекул цитокинов семейства интерлейкина-1 на данный момент входят 10 молекул. Лиганды семейства интерлейкина-1 связываются со специфичной для них рецепторной субъединицей в области, состоящей из трех иммуноглобулин-подобных доменов. Рецепторы этого семейства можно разделить на две группы: содержащие внутриклеточный домен для сигнальной трансдукции и не содержащие такого домена. В большенстве случаев рецеторы интерлейкинов семейства интерлейкина-1 представляют из себя гетеродимерные комплексы. Рецепция лигандов происходит следующим образом: сначала лиганд взаимодействует со специфичной рецепторной субъединицей, и если лиганд обладает агонистическим действием (например, IL-1β, IL-36γ), то полученный комплекс приобретает способность рекрутировать вспомогательную корецепторную субъединицу с образованием активного гетеродимерного рецептора (гетеротримерного, если считать с лигандом). В то же время, взаимодействие рецепторной субъединицы с лигандом-антагонистом (IL-1Ra, IL-36Ra) не приводит к образованию такого комплекса. [54] Последствием такого двухэтапного способа образования активного рецептора, кроме наличия лигандов-антагонистов является то, что для повторения биологической активности не подходят пептидные фрагменты молекул, необходимо использование крупных рекомбинантных аналогов.

Каждая рецепторная и корецепторная субъединица в случае сигнально-активного рецептора, кроме внеклеточного иммуноглобулин-подобного участка связывания имеет и внутриклеточную часть, ответственную на передачу сигнала о рецепции в клетку посредством вторичных посредников.. Если классифицировать клеточные рецепторы, исходя из строения их внутриклеточных доменов, то следует выделить суперсемейство TIR-рецепторов, часть из которых имеею иммуноклобулин-подобные внеклеточные домены (рецепторы семейства интелейкина-1), а часть – лейцин-богатые внеклеточне домены (TLR). [16, 63]

Рассмотрим более подробно каскад внутриклеточной сигнальной трандукции в клетках в ответ на Ил-1. При этом следует заранее добавить, что это некий суммирующий пример, в конкретных клетках после различных преформаций и изменений этот каскад может идти иначе.

При стимуляции IL-1R, как описано выше, происходит димеризация рецептора. Внутриклеточные TIR-домены, в ходе белок-белковых взаимодействий аутофосфорилируются и измениют конформацию, что открывает участки, рекрутирущие адаптерную молекулу MyD88 и Tollip. При этом происходит конформационное изменение обнажающее death-домен молекулы MyD88, с одной стороны, и наоборот дезактивирует такой домен у Tollip. Благодаря этому киназа IRAK4, и IRAK1 рекрутируются в этот комплекс, образуя димер, в котором IRAK4 активируется и гиперфосфорилирует киназу IRAK1, что создает возможность для привлечения в комплекс также фактора Pellino-1. После этого взаимодействия, гиперфосфорилированный IRAK1 приобретает сильный отрицательный заряд и весь полученный комплекс диссоциирует от рецептора. Далее, киназа IRAK-1 взаимодействует мембрано-ассоциированным адапторным белком киназы TAK-1 (она является MAPKKK) TAB-2, который подвергаются фосфорилированию и весь комплекс IRAK1-TAB2 диссоциируют в цитозоль. Здесь этот комплекс рекрутирует MAPKKK TAK1, ассоциированную с адапторным белком TAB-1, а также становится скеффолдом олигомеризации TRAF6 и его аутоубквитинилирования опосредованного убиквитин-лигазами Ubc13 и Uev1A. Убиквитинилированный TRAF6 фосфорилирует и освобождает от TAB-1 киназу TAK-1. В конечном итоге TAK-1 фосфорилирует киназу IKKβ, которая, фосфорилируя ингибирующий фактор IkB. TRAF6 убиквитинилирует этот ингибирующий фактор, что приводит к его убиквитин-опосредованной протеосомной деградации. Это, в свою очередь, высвобождает димерный транскрипционный фактор NFkB, который после транслокации в ядро непосредственно стимулирует экспрессию генов. [42, 54, 69, 73]. Активированный TAK-1 также индуцирует активацию некоторых MAPKK-6, что приводит к включению транкрипционных факторов c-Jun, с-Fos (в гетеродимерном состоянии – транскрипционный фактор AP-1). Терминация сигнального каскада происходит вследствие деградации гиперфосфорилированного IRAK1, что приводит к резрушению IRAK1-TRAF6-TAB2-TAK1 сигналосом. [54, 4]

Из 10 представителей семейства рецепторов IL-1 четыре являются специфическими рецепторными субъединицами (IL-1RI, IL-18Rα, IL-36R, ST2), два – корецепторными (IL-1RAcP, IL-18Rβ), часто общими для нескольких лигандов семейства интерлейкина-1, все эти молекулы имеют описанное выше строение (три внеклеточных иммуноглобулин-подобных домена связывания, внутриклеточный TIR-домен). Кроме того, в семейство входит рецептор-ловушка, у которого отсутствует внутриклеточный TIR-домен, функциональное значение которого состоит в ингибировании, сдерживании влияния лигандов IL-1 (IL-1R2), и рецептор с единственным внеклеточным иммуноглобулиновым доменом, задача которого ингибировать каскад внутриклеточной трансдукции TIR-доменов, конкурентным способом, секвестрируя адаптерные компоненты этого сигналлинга без их активации (IL-1R8). Еще два представителя до сих пор не имеют доказанных лигандов, их функции также не определены. [63]

Таблица 2. Рецепторы семейства интерлейкина-1

Названия рецептора	Ген	лиганд	функция
IL-1R1, IL-1RI	IL1R1	IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-38	Рецепторная субъединица IL-1
IL-1R2, IL-1RII	IL1R2	IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-38	Рецептор-ловушка, подавляет действие IL-1
IL-1R3, IL-1RAcP	IL1RAP	Комплекс IL-1RIxIL-1α/β или IL-1R4xIL-33 или IL-36RxIL-36α/β/γ	Корецепторная субъединица IL-1, IL-33, IL-36
IL-1R4, ST2	IL1RL1	IL-33	Рецепторная субъединица IL-33
IL-1R5, IL-18Rα	IL18R1	IL-18, IL-37	Рецепторная субъединица IL-18
IL-1R6, IL-36R	IL1RL2	IL-36α/β/γ, IL-36Ra, IL-38	Рецепторная субъединица IL-36
IL-1R7, IL-18Rβ	IL18RAP	Комплекс IL-18RαxIL18	Корецепторная субъединица IL-18
IL-1R8, TIR8	SIGIRR	нет	Ингибирование внутриклеточной активации рецепторов суперсемейства TIR
IL-1R9, APL, IL-1RAPL или TIGIRR-2	IL-1RAPL1	?	?
IL-1R10, TIGIRR, или TIGIRR-1	IL-1RAPL2	?	?

Из того факта, что рецепторы семейства интерлекина-1 имеют общие пути внутриклеточной сигнальной трандукции следует, что для осуществения эффектов различных представителей этого семейства должно наблюдаться различное распределение рецепторов этих цитокинов на субпопуляциях клеток. Так, рецептор, специфичный к IL-1α и IL-1β распространен практически на всех типах клеток организма. Однако, рецепторы IL-33 преимущественно распространены на тучных клетка, фибробластах, Th2, а рецепторы IL-18 – на макрофагах моноцитарного происхождения, нейтрофильных гранулоцитах, Th-1, NK-клетках, клетках эндотелия и гладкомышечных клетках сосудов. Наличие же рецептора IL-36 характерно для покровных эпителиев: эпителициты и фибробласты легких и кожи, это основные IL-36R-положительные клетки, кроме того, этот рецептор распространен на дендритных клетках макрофагального происхождения в коже и незрелых Т-лимфоцитах.

Гены семейства IL-1

Гены всех представителей семейства интерлейкина-1, за исключением IL-18 [60] и IL-33 [74], компактно локализованы в пределах одного кластера генов, протяженностью около 300 тысяч пар нуклеотидных оснований на длинном плече второй хромосомы (2q13). [59]

Клонирование кодирующих последовательностей IL-1α и IL-1β человека было впервые осуществлено еще 80-х годах [93, 51]. На данный момент клонированы и характеризованы все гены представителей этого семейства. Исследование устройства их генов показало высокую степень консервативности распределения, структуры и числа экзонов в генах этих белков. Анализ нуклеотидных последовательностей генов IL-1F выявил существование трёх “общих” кодирующих экзонов (common exons, CE), наличие которых характерно для большинства генов IL-1F, соответствующих главной глобулярной части белковой молекулы после процессинга (смотри далее) и фолдинга. Так, экзон CE1 кодирует три первых β-складчатых консервативных мотива от S1 до S3, CE2 – кодирует S4, S4, S6, и почти весь S7, а CE3 соответствует участкам β-складок с S8 до S12 [59]. Таким образом, молекулы членов семейства IL-1 содержат 12 β-складчатых консервативных участков и гибкие петли между ними [26]. Именно эта трехмерная структура белка, важная для рецепции лиганда, получившая название β-трилистника, характеризует структурно всех представителей IL-1F.

Структура молекул IL-1F и важнейшие молекулярные детерминанты рецепции

Важно упомянуть, что все представители семейства IL-1 транслируются в виде неактивного предшественника. Для их активации требуется протеолитическое пострансляционное отщепление пропептидных участков различными протеазами (в основном, это провоспалительные каспазы, но бывает иначе, о чём ниже). При этом следует заметить, что эти пропептидные фрагменты не являются сигнальными участками и не участвуют в направлении транслируемого белка по пути канонического везикулярного транспорта или другого типа внутриклеточной транслокации. Именно зрелые молекулы с процессированными пропепдидными фрагментами изучаются структурно. Как уже говорилось, молекулы представителей этот семейства имеют в своем составе 12 бета-складчатых участков, образующих 3 группы по 4 бета-складки. Эти молекулы могут быть как стабилизированы дисульфидными связями, так и не иметь оных в составе, в них отсутствуют ионы металлов, часть из этих белков подвергается посттрансляционному гликозилированию.

Для целей современной белковой инженерии (рациональный дизайн улучшенных по сравнению с природными антагонистов) чрезвычайно важными являются подробные данные не просто о кристаллической структуре молекул интереса, но скорее о молекулярной структуре комплексов лигандов с рецепторами, в подробностях конкретных межатомных взаимодействий. Поэтому, структура комплексов лигандов семейства интерлейкина-1 с их рецепторами изучается в последнее время очень подробно. На данный момент с помощью методов РСА и ППР изучены структуры и рецепторные детерминантны этих интерлейкинов [40, 76, 47, 89]. Несмотря на большое структурное сходство между цитокинами этого семейства, вплоть до одинаковых аминокислотных остатков в консервативных участках, результаты этих исследований говорят о том, что конкретные межатомные взаимодействия, отвечающие за рецепцию агонистов и антагонистов различных групп цитокинов этого семейства различаются. Рассмотрим для примера молекулярные детерминанты взаимодействия с рецепторами агонистов и антагонистов IL-1 и IL-36. Кристаллические структуры тройного комплекса IL-1R/IL-1β/IL-1AcP показывают, что рекрутирующее корецепторную субъединицу взаимодействие происходит посредством комбинированной молекулярной поверхности как лиганда, так и конформационно изменившегося первичного рецептора. Основные области лиганда, опосредующие взаимодействие с AcP: петля между 4 и 5 β-складками (β4/5), петля между 11 и 12 β-складками (β11/12). Именно в этих областях в молекулах-агонистах присутствуют аминокислотные остатки с отрицательно-заряженными боковыми цепями (Asp54 в β4/5, Asp145 в β11/12), которые образуют стабилизирующие водородные связи с боковыми цепями аминокислотных остатков (Arg286, Ser185, соответственно) в составе корецепторной субъединицы. На аналогичных позициях в молекуле-антагонисте (IL-1Ra) присутствуют аминокислотные остатки с положительно-заряженными боковыми цепями (Lys145 β11/12), либо петля не имеет достаточной длины (β4/5), что предотвращает стабильное крепление корецептора к лиганду. [83; 92]. Результаты исследования кристаллической структуры IL-36γ и IL-36Ra с помощью рентгеноструктурного анализа показали, что оба цитокина имеют типичную для IL-1F структуру бета-трилистника и похожи по структуре на свои функциональные аналоги. При сравнении молекулярных архитектур IL-36γ и IL-36Ra оказалось, что именно в областях β4/5 и β11/12 эти цитокины обнаруживают наибольшее конформационное различие, это, на первый взгляд, подтверждало предполагаемую до того концепцию о единообразии механизма рецепции IL-1 и IL-36. Однако, если углубиться в детали взаимодействий, всё окажется гораздо сложнее. Во-первых, в конформационных позициях, в которых в IL-1β присутствуют отрицательно-заряженные аминокислотные остатки, в IL-36γ находятся либо незаряженная аминокислота (Ala162 в β11/12), либо (Arg71 в β4/5) заряженная боковая цепь уже занята созданием связи внутри молекулы IL-36γ. Более того, IL-36Ra в позиции, в которой следовало бы ожидать аминокислоту с положительно заряженной боковой цепью, имеет отрицательно заряженную (Asp148), из-за чего изначально у него предполагалась агонистическая активность [26]. Во-вторых, при создании химерных молекул, у которых различным образом комбинировались β4/5-петли и β11/12-петли со структурой, характерной для антагониста и агониста, выяснилось следующее. При интродукции “агонистических” петель в антагонист, происходила потеря им антагонистической активности и приобретение хоть и слабого, но активирующего действия. В то время как превращение агониста в антагонист при обмене его петель на “антагонистические” не происходило. Говоря короче, несмотря на то, что архитектура взаимодействия рецепторов и лигандов IL-1 и IL-36 очень похожа, частности взаимодействия при рецепции IL-36 и IL-1 значительно отличаются [26; 33].