Учет РТГА при идентификации вирусов

Противогриппозная сыворотка А	Гемаглютинины блокируются антителами	РТГА «+»
Противогриппозная сыворотка В								РТГА «-»
Гемаглютинины не блокируются антителами

Реакция торможения гемадсобции (РТГадс). Используется для идентификации гемадсорбирующих вирусов. Для этого диагностическую сыворотку в разведении 1:5 и количестве 0,2 мл вносят в пробирки с вирусинфицированной клеточной культурой, выдерживают в течение 30-60 минут и добавляют 0,2 мл 0,5 % взвеси эритроцитов. Пробирки инкубируют 20-30 минут при температуре, оптимальной для гемадсорбции выделяемого вируса. Если антигены вируса гомологичны антителам сыворотки, то вирусы утрачивают способность адсорбировать эритроциты на поверхности клеток культуры. В этом случае РТГадс считается положительной, а выделяемый вирус идентифицируется по диагностической сыворотке. При негомологичности вирусных антигенов антителам диагностической сыворотки эритроциты адсорбируются на клетках, словно РТГадс отрицательная, а вирус не идентифицирован.

Реакция пассивной (или непрямой) гемагглютинации (РПГА или РНГА). Для идентификации вирусов в РПГА (РНГА) используется эритроцитарный антительный диагностикум. То есть на эритроцитах находятся фиксированные Fc-концом антитела, антигенсвязывающие детерминанты которых остаются свободными и способны взаимодействовать с гомологичным антигеном.

Реакцию осуществляют путем смешивания равных объемов вируссодержащей жидкости и эритроцитарного антительного диагностикума, с последующей их инкубацией при 37˚С в течение 30 минут.

При гомологичности антигенов вирусов антителами диагностикума происходит агглютинация эритроцитов – реакция считается положительной, а вирус идентифицируется по антительному диагностикуму. При несоответствии вирусных антигенов антителам агглютинация не наступает – реакция считается отрицательной, а вирус – не идентифицированным.

Реакция связывания комплемента (РСК). Используется для идентификации адено-, герпес-, ортомиксо-, парамиксо-, арена-, бунья-, рота- и тогавирусов. В реакции участвует 2 системы: диагностическая и индикаторная. Диагностическую систему составляют: 1) неизвестные вирусы, которые необходимо идентифицировать; 2) специфическая (диагностическая) иммунная сыворотка; 3) комплемент. Индикаторную систему составляют: 1) эритроциты барана; 2) гемолитическая иммунная сыворотка, вызывающая гемолиз эритроцитов при наличии свободного комплемента.

Пробирку заполняют равными количествами компонентов диагностической системы и инкубируют в течение 45 минут при 37˚С. Затем в пробирку добавляют индикаторную систему и выдерживают в термостате при 37˚С 30 минут, после чего производят учет реакции.

Если антигены идентифицируемых вирусов окажутся гомологичными антителам диагностической сыворотки, то образуется комплекс антиген-антитело, но поскольку свободного комплемента нет, гемолиза эритроцитов не происходит и они оседают на дно пробирки. В этом случае РСК считается положительной, а неизвестный вирус идентифицируется по диагностической сыворотке.

Если антигены идентифицируемых вирусов негомологичны антителам диагностической сыворотка, то комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается в несвязанном состоянии. Он взаимодействует с комплексом антиген-антитело, образованным компонентами индикаторной системы. Вследствие этого происходит гемолиз эритроцитов. В этом случае РСК считается отрицательной, а неизвестный вирус остается не идентифицированным.

Иммуноферментный анализ (ИФА).Относится к твердофазным иммуносорбентным методам исследования. В качестве твердофазного носителя в ИФА используются планшеты, пробирки, пленки из полистирола, который обладает высокой сорбционной способностью. Для идентификации вирусов известный компонент реакции – антитело сорбируют на твердую фазу. Затем вносят вируссодержащий материал и инкубируют. Если антигены вирусов гомологичны антителам, то образовавшийся комплекс не будет удален при отмывке твердой фазы. После отмывки вносят противовирусные или антивидовые антитела, меченные ферментом, которые взаимодействуют с вирусными антигенами в случае их гомологичности. Для визуализации реакции добавляют субстрат – хромоген, способный изменять цвет среды под действием фермента. Результаты ИФА учитывают с помощью приборов (ридеров) по интенсивности окрашивания хромогена. При положительном результате ИФА вирусы идентифицируют по использованным диагностическим антителам.

Радиоиммунный анализ (РИА). Представляет собой разновидность твердофазного иммуносорбентного метода исследования. Методика проведения РИА аналогична методике постановки ИФА, за исключением 2 конечных этапов. В отличие от ИФА, в РИА используют противовирусные антивидовые антитела, меченные не ферментом, а радионуклидом (обычно I¹²⁵), а учет результатов проводят с помощью счетчиков радиоактивности (γ-счетчиков).

§ 2. Вирусоскопический метод диагностики.Проводится 3 способами: 1) световая иммерсионная микроскопия; 2) люминесцентная микроскопия; 3) электронная микроскопия.

Световая иммерсионная микроскопия имеет ограниченное применение. Используется в настоящее время при диагностике бешенства, цитомегаловирусной и энтеровирусной инфекции. Световая иммерсионная микроскопия позволяет выявлять внутриклеточные включения, состоящие из агрегатов вирионов. Для диагностики бешенства готовят отпечатки ткани гиппокампа, мозжечка или коры большого мозга на предметном стекле, окрашивают по Романовскому-Гимзе, Туревичу или Муромцеву, высушивают и микроскопируют. При бешенстве в цитоплазме крупных нейронов видны кристаллоподобные скопления вирусов бешенства – тельца Бабеша-Негри – продолговатые или сферические образования розовато-фиолетового цвета диаметром 2-10 мкм с видимой внутренней структурой. Обнаружение телец Бабеша-Негри является экспресс-диагностическим тестом при бешенстве. При диагностике цитомегаловирусной инфекции клетки из осадка мочи, слюны, спинномозговой жидкости или почечные биоптаты окрашивают азур-эозином или гематоксилин-эозином. Поражение цитомегаловирусом проявляется в образовании гигантских клеток (25-40 мкм), содержащих тёмные тельца включений, окруженные светлой полоской («совиные глаза»). При энтеровирусной инфекции в пораженных клетках отмечается смещение хроматина к периферии ядра и образование вытесненных из осветлённого ядра ярко-фиолетовых полулуний.

Люминесцентная микроскопия. Проводится при помощи люминесцентного микроскопа и люминесцирующих антител (сывороток). Данный способ вирусоскопической диагностики известен также как реакция иммунофлюоресценции (РИФ), которая имеет широкое применение, поскольку позволяет проводить диагностику большинства вирусных инфекций. РИФ высоко специфична и чувствительна (рис. 8).

Известны 3 основных модификации метода: прямая, непрямая и антикомплементарная РИФ.

При прямой РИФ используют люминесцирующие антитела против каждого изучаемого антигена. На препарат с фиксированными инфицированными клетками наносят на 30 минут при 25˚С диагностические люминесцирующие антитела, после чего препарат промывают забуференным солевым раствором 10 минут при температуре 25˚С и просматривают в люминесцентном микроскопе. Комплекс антиген-антитело обнаруживается по свечению.

При непрямой РИФ используется 2 типа антител, вначале для выявления антигена применяют диагностические антитела, не меченные флюорохромом, а на втором этапе реакции образовавшийся комплекс антиген-антитело обрабатывают люминесцирующими антителами, направленными против первых антител. Отмывание препарата проводится после каждого использования антител.

Антикомплементарная РИФ применяется в тех случаях, когда комплекс антиген-антитело способен фиксировать комплемент. Реакция проводится в 3 этапа. На первом этапе на препарат с фиксированными инфицированными клетками наносят немеченные диагностические антитела. На втором этапе к комплексу антиген-антитело добавляют комплемент морской свинки (1:10) на 30 минут при 37˚С во влажной камере, после чего промывают солевым раствором. На третьем этапе к комплексу антиген-антитело-комплемент добавляют антикомплементарные антитела, меченные флюорохромом, выдерживают 30 минут, после чего препарат промывают и изучают в люминесцентном микроскопе.

Электронная микроскопия.Является единственным методом экспресс-диагностики, позволяющим визуально выявить вирусы в клиническом материале независимо от их размеров. Наиболее успешно электронная микроскопия применяется для обнаружения некультивируемых вирусов и вирусов, для которых нет других тест-систем. Электронная микроскопия осуществляется при помощи электронного микроскопа просвечивающего типа. Электронный микроскоп состоит из вертикальной колонны, в которой размещены электронная пушка и система электромагнитных линз, и пульта управления. Пучок электронов, просвечивая объект, взаимодействует с атомами его вещества, что ведет к изменению траекторий электронов. Электроны, попадая на флюоресцирующий экран электронного микроскопа, формируют изображение изучаемого объекта. Кратность увеличения при электронной микроскопии составляет 30-60 тысяч раз.

При проведении неиммунной электронной микроскопии вируссодержащий материал после предварительной очистки и негативного контрастирования фосфорно-вольфрамовой кислотой наносят на металлическую сеточку и просматривают в электронном микроскопе.

Более чувствительным и специфичным является метод иммунной электронной микроскопии. Для этого вируссодержащий материал предварительно смешивают с диагностическими антителами, что ведет к образованию агрегатов вирусных частиц. Образовавшиеся микропреципитаты осаждают центрифугированием, негативно контрастируют, наносят на металлическую сеточку и изучают в электронном микроскопе. Иммунная электронная микроскопия позволяет выявлять вирусы в исследуемом материале, идентифицировать их по взаимодействию со специфическими антителами, а также дифференцировать вирусы одного семейства по антигенным свойствам, титровать антитела к ним, определять локализацию вирусных антигенов внутри клеток.