Тема № 7. Дослідження процесів біотрансформації каенобіотиків та ендогенних токсинів. Мікросомальне окиснення, цитохром Р-450.
Мета заняття: Вміти трактувати біохімічні механізми функціонування детоксикаційної системи печінки: реакції мікросомального окиснення та кон’югації в біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Вміти пояснювати біохімічні основи розвитку недостатності функцій печінки за умов хімічного, біологічного та радіаційного ураження.
Актуальність теми: У печінці знешкоджуються ендотоксини та ксенобіотики, які є чужорідними для нормальних метаболічних шляхів, можуть змінювати і порушувати перебіг обмінних процесів, а в умовах перебігу патології лікарські засоби можуть нормалізувати метаболізм і тим самим зумовити видужування хворого Знання кінетики всмоктування, транспорту, розподілу, метаболізму речовин в організмі є основою для розробки лікарських форм із заданими властивостями.
Теоретичні питання
1. Детоксикаційна функція печінки; біотрансформація ксенобіотиків та ендогенних токсинів.
2. Типи реакцій біотрансформації чужорідних хімічних сполук у печінці.
3. Реакції мікросомального окиснення; індуктори та інгібітори мікросомальних монооксигеназ.
4. Реакції кон’югації в гепатоцитах: біохімічні механізми, функціональне значення.
5. Електронно-транспортні ланцюги ендоплазматичного ретикулуму. Генетичний поліморфізм та індуцибельність синтезу цитохрому Р-450.
6. Виникнення і природа розвитку толерантності до лікарських засобів.
Практична робота
Дослід 1. Оцінка ступеня ендогенної інтоксикації за методом М.Я. Малахової
Молекули середньої маси (за класифікацією М.Я. Малахової) складаються з 2-х груп сполук – речовин низької (РНММ) і середньої молекулярних мас (РСММ) і олігопептидів (ОП), що мають молекулярну масу меншу 10 кДА. РНММ і РСММ – це речовини небілкової природи: креатинін, сечовина, олігоцукри, молочна кислота, білірубін, амінокислоти, холестерин, продукти пероксидного окиснення ліпідів та ін. До ОП входять регуляторні пептиди (нейротензини, соматостатин, вазоактивний інтестинальний пептид, енкефіліни та інші біологічно активні речовини (БАР). Перераховані вище сполуки – це фізіологічні компоненти, які входять в поняття «молекули середньої маси» (МСМ). Патологічними компонентами є продукти некерованого протеолізу і деструкції органів тканин, мікробні токсини, гідропероксиди, поліаміни, а також збільшення концентрації фізіологічних компонентів.
Накопичення великої концентрації МСМ і порушення їх розподілення між плазмою і еритроцитами, а також порушення їх виділення нирками, викликаними різними етіологічними факторами, призводить до розвитку ендогенної інтоксикації організму.
А) Визначення РНММ і РСММ за методом М.Я. Малахової:
Принцип методу: Полягає в реєстрації неосаджених ТХО компонентів плазми і еритроцитів в діапазоні довжин хвиль 238-300 нм.
Матеріальне забезпечення:15 % розчин трихлорацетатної кислоти (ТХАК); 0,9% розчин хлориду натрію; дистильована вода; спектрофотометр; центрифуга.
Хід роботи:Для дослідження використовують плазму і еритроцити. Послідовність проведення етапів дослідження наведена в таблиці. Проби перемішують і визначають екстинкцію (Е) в діапазоні 238-300 нм з інтервалом 4 нм на спектрофотометрі проти контролю в кюветі з товщиною шару 10 мм.
Визначення РНММ і РСММ
| Досліджувані проби | |||
| Реактив і матеріал | Контроль (мл) | Плазма (мл) | Еритроцити (мл) |
| Плазма | 1,0 | ||
| Еритроцити | 0,5 | ||
| Розчин NаСІ 0,9% | 0,5 | ||
| Н2О | 1,0 |
Проби енергійно струшують
| Розчин ТХАК 15% | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Проби перемішують і через 5-7 хв центрифугують при 3000 об/хв. 30 хв.
| Надосадова рідина | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Н2О | 4,5 | 4,5 | 4,5 |
Розрахунок проводять шляхом множення суми отриманих значень екстинкції на крок довжини хвилі.
РНММ і РСММ {плазми, еритроцитів}= (А238 + А242 + А246 + …. + А300 ) х 4 (ум.од.)
Нормативні величини: