Выделение нуклеиновых кислот

Министерство образования и науки рф

БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА

Учебное пособие

Уфа

РИЦ БашГУ

УДК 575+577

ББК 28.04+28.070+28.704+52.5

М

Печатается по решению учетно-методической комиссии биологического факультета Башкирского государственного университета,

протокол №7 от 21.06.2013г.

Рецензенты: ИБГ УНЦ РАН, проф., д-р биол. наук, О.Е.Мустафина (г.Уфа);

кафедра биологии Башкирского государственного

медицинского университета», (г.Уфа)

Нургалиева А.Х., Карунас А.С., Хусаинова Р.И., Хидиятова И.М., Ахметова В.Л., Валиев Русл.Р., Надыршина Д.Д., Мустафин Р.Н., Мурзабаева С.Ш., Хуснутдинова Э.К.

Молекулярно-генетические методы изучения наследственных болезней человека: учеб. пособие – Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. – 102с.

Пособие предназначено дня студентов биологического факультета, специализирующихся на кафедре генетики и фундаментальной медицины БашГУ. Издание составлено с учетом учебной программы курса лекций и практических занятий по дисциплине «Большой практикум». Цель учебного пособия – ознакомление с основными молекулярно-генетическими методами изучения наследственных болезней человека и методикой их проведения. Описаны методы выделения нуклеиновых кислот, ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, ПДРФ-анализ, гель-электрофорез, секвенирование и др. Даны некоторые комментарии к методикам для успешного выполнения лабораторных работ и научных исследований.

© БашГУ, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение……………………………………………………………….... 1. Выделение нуклеиновых кислот…………………………….. 1.1. Выделение ДНК………………………………………….. 1.2. Выделение РНК…………………………………………...   2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК и ее модификации………………………………………………….. 2.1. Механизм, компоненты и методика проведения ПЦР… 2.2. ПЦР в режиме реального времени……………................. 2.3. ПЦР с обратной транскрипцией…………………………   3. Электрофорез ДНК…………………………………………….   4. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов………   5. Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК……………….................   6. Секвенирование ……………………………………………..   7. Метод биочипов ……………………………..........................   Список использованной литературы…………………………………..   Приложение……………………………………………………………..

Список сокращений

дНТФ (dNTP) - кДНК – ЛУК –	Дезоксинуклеозидтрифостаты Комплиментарная ДНК Ледяная уксусная кислота
МБА – Мл мкг	Метиленбисакриламид
НП – нм НК – ОТ –	Нуклеотидные последовательности   Нуклеиновая кислота Обратная транскрипция
ПДРФ – пг	Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
п.н. –	Пар нуклеотидов
ПСА –	Персульфат аммония
ТАЕ –	Трис-ацетат-ЭДТА
ТВЕ –	Трис-борат-ЭДТА
Трис –	Трис-(оксиметил)-аминометан (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол)
ЭДТА –	Этилендиаминтетраацетат
CAPS –	Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (Рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей)
CCM –	Chemical Cleavage of Mismatch (Метод химического расщепления неспаренных оснований)
DGGE –	Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (Денатурирующий градиентный гель-электрофорез)
DHPLC –	Denaturation High Performance Liquid Chromatography (Денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения)
FISH –	Метод флюоресцентной гибридизации in situ
SDS –	Додецилсульфат натрия
SNP –	Single Nucleotide Polymorphism
SSCP – μМ	Single Strand Conformation Polymorphism

Введение

Стремительное развитие технологий высокопроизводительных генетических исследований дало возможность иначе взглянуть на подходы к получению информации о геноме человека. Молекулярно-генетические методы исследования, постоянно совершенствующиеся в последние десятилетия, значительно облегчили проведение диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. С каждым годом появляются новые методологические подходы, открывающие огромные перспективы успешного поиска генетических маркеров и факторов развития как моногенных, так и многофакторных заболеваний человека. Несмотря на то, что методы данной группы, как правило, весьма сложны, трудоемки и дорогостоящи, данные, полученные в процессе ДНК-диагностики намного точнее и информативнее результатов других анализов. Медико-биологическое сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностики и начала лечения болезни до появления ее симптомов. Знание теоретических основ и владение данными технологиями необходимо для успешной профессиональной деятельности специалиста в области генетики.

Учебное пособие создано в связи с необходимостью представить методологию молекулярно-генетического исследования в виде отдельного руководства, в котором можно найти основные необходимые в практической работе данные по методам исследования ДНК человека студентам биологических факультетов, а также аспирантам и научным сотрудникам молекулярно-генетических лабораторий. В данном учебном пособии методы рассматриваются в соответствии с последовательностью их проведения, начиная с выделения ДНК и РНК, ПЦР, гель-электрофореза, заканчивая методом ПДРФ, SSCP, секвенирования, микрочипирования. Предложены методики проведения экспериментов, даны комментарии для успешного выполнения лабораторных работ и научных исследований. Особое внимание уделяется наиболее современным модификациям молекулярно-генетических методов исследования, таким как полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности, методы полногеномного секвенирования, различные модификации ПЦР в реальном времени и др. Данное учебное пособие поможет студентам успешно освоить методы молекулярно-генетического анализа и применять их при выполнении научных исследований, курсовых и дипломных работ, а также обобщить знания при подготовке к экзаменам.

ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Для проведения молекулярного анализа нуклеиновых кислот, нужно, прежде всего, получить их в чистом виде. Если источником НК служит клинический образец, то необходимо подобрать оптимальные методы выделения, позволяющие получить максимальное количество высокочистого продукта.

Типичная диплоидная клетка человека в норме содержит примерно 7 пг геномной ДНК и разное количество митохондриальной ДНК. Таким образом, суммарный продукт, выделяемый из клинических образцов, представляет собой смесь геномной и митохондриальной ДНК. Получить чистую геномную ДНК можно только одним способом: выделением ядер и освобождением из них ДНК. Впрочем, в большинстве случаев эксперименты можно проводить на суммарной ДНК, поскольку митохондриальная ДНК обычно не мешает анализу.

Типичная клетка млекопитающих содержит около 15 пг РНК. Из них 80-85% приходится на долю рибосомной (28S, 18S, 5S) РНК, а остальная часть представлена в основном низкомолекулярными РНК (транспортными и малыми ядерными). И лишь 1-5% суммарной РНК составляет информационная РНК (мРНК), гетерогенная как по размеру, так и по первичной структуре. В большинстве случаев на 3’-конце мРНК эукариот находится poly(A)-«хвост».

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации. В качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации, наряду с очищенной ДНК, используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, соскобы букальных клеток и смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие неприкрепившиеся и не давшие роста клетки, соскобы с цитогенетических препаратов и длительно хранившиеся фиксированные ткани, полученные при паталогоанатомическом анализе. Иногда бывает достаточно прокипятить образец в течение 5-10 минут, однако в большинстве случаев требуются более трудоемкие методы.