Биосинтез белка (трансляция)
Генетическая информация, хранящаяся в ДНК, передается на РНК:
ДНК- нематричная цепь (кодирующая, или смысловая) 5′-ГГАТГЦАТ-3′
ДНК- матричная цепь (некодирующая, несмысловая) 3′-ЦЦТАЦГТА-5′
Цепь мРНК 5′-ГГАУГЦАУ-3′
У вирусов часто матричную цепь называют (-)-цепью, а нематричную (+)-цепью.
Биосинтез полипептида или белка на матрице РНК называется трансляцией.
Строение рибосом
Внутриклеточный компонент, в котором сходятся и взаимодействуют все элементы механизма трансляции белка, называется рибосомой. Несколько рибосом могут одновременно транслировать одну и ту же цепь мРНК, образуя полисомы (полирибосомы). Шероховатый эндоплазматический ретикулум – это компартмент клетки, в котором мембраносвязанные полисомы продуцируют как мембранные белки, так и белки, подлежащие транспорту и экскреции. Рибосомы эукариот в 2 раза больше рибосом прокариот.
Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие из РНК и белков в соотношении 1:1 у 80S рибосом эукариот и 2:1 у 70S рибосом прокариот. Рибосомные РНК синтезируются в ядрышке, белки образуются в цитоплазме и переносятся в ядрышко. Здесь спонтанно образуются рибосомные субчастицы путем объединения белков с соответствующими рРНК. Рибосомы состоят из 2-х субъединиц. Большая (50S у прокариот и 60S у эукариот) и малая (30S у прокариот и 40S у эукариот) субъединицы рибосом через поры ядерной оболочки переносятся в цитозоль. Большая субъединица рибосом эукариотической клетки содержит 41 белок, 5S, 5,8S и 28S рРНК, малая субъединица – 30 белков и 18S рРНК. Согласно представлениям Дж. Уотсона существует «рибосомный цикл»: в начале синтеза полипептидной цепи субъединицы рибосом объединяются в функционирующую рибосому на мРНК для осуществления трансляции, а в конце синтеза диссоциируют.
Генетический код
Информация о последовательности аминокислот в полипептидной цепи записана на мРНК в виде трехбуквенного нуклеотидного кода.
Свойства генетического кода:
1. Триплетность– каждая аминокислота кодируется 3 нуклеотидами (кодоном).
2. Вырожденность (избыточность) – каждая аминокислота кодируется несколькими триплетами. Последовательность первых двух нуклеотидов определяет в основном специфичность каждого кодона, третий нуклеотид имеет меньшее значение. Данное свойство повышает устойчивость генетической информации к воздействию неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды.
3. Специфичность – каждому кодону соответствует только 1 аминокислота.
4. Неперекрываемость – нуклеотид, входящий в состав одного триплета не может входить в состав соседнего.
5. Однонаправленность – считывание информации идет в направлении 5’®3’.
6. Коллинеарность – соответствие последовательности аминокислот в белке последовательности триплетов в мРНК.
7. Универсальность – соответствие аминокислот триплетному коду у всех живых организмов.
Среди 64 триплетов мРНК выделяют 3 типа: 1) инициирующий – АУГ: кодирует включение формилметионина у прокариот или метионина у эукариот, если стоит вначале мРНК, и определяет стадию начала (инициации) синтеза белковой молекулы; если находится в середине – то является смысловым; 2) смысловые кодоны – кодируют включение аминокислот в синтезируемую полипептидную цепь; 3) терминирующие кодоны не кодируют включение аминокислот, это нонсенс-кодоны, которые определяют завершение (терминацию) синтеза полипетидной цепи.
Биосинтез белка
В процессе биосинтеза белка выделяют 5 основных стадий.
9.6.3.1. Стадия 1 - активация аминокислот.Этот процесс протекает в цитозоле, а не в рибосоме. Каждая из 20 аминокислот ковалентно присоединяется к определенной тРНК, используя для этого энергию АТФ. Значение стадии: 1) активация СООН-группы аминокислоты, которая может участвовать в образовании пептидной связи; 2) аминокислоты сами не могут узнавать кодоны мРНК, а переносятся к рибосомам тРНК, которые посредством специфических антикодонов узнают кодоны мРНК и выполняют, таким образом, роль адапторных молекул.
Необходимые компоненты:
1)20 аминокислот; 10 аминокислот являются незаменимыми и должны поступать с пищей; если отсутствует хотя бы одна аминокислота, процесс биосинтеза белка прекращается;
2) ферменты аминоацил-тРНК-синтетазы;
3) тРНК;
4) АТФ;
5) Mg2+.
Активация аминокислот и их присоединение к тРНК осуществляется специфическими аминоацил-тРНК-синтетазами, которые называют активирующими ферментами.
Общий вид катализируемой реакции может быть выражен уравнением:
Аминокислота + тРНК +АТФ+ Mg2+® Аминоацил-тРНК + АМФ + РРн
Фермент аминоацил-тРНК-синтетаза обладает специфичностью к аминокислоте и к тРНК. Фермент имеет 4 центра связывания: 1) для тРНК; 2) для АТФ; 3) для аминокислоты; 4) для воды. Гидролитическая активность фермента необходима для удаления «неправильной» аминокислоты с последующим присоединением «правильной» аминокислоты к тРНК. Аминокислоты, для которых имеется две и более тРНК, активируются обычно одним ферментом.
9.6.3.2. Стадия II: инициация полипептидной цепи
Необходимые компоненты:
1) мРНК;
2) инициирующая аминоацил-тРНК (N-формилметионил-тРНК);
3) инициирующий кодон мРНК (АУГ)
4) 30S и 50S субъединицы рибосом;
5)ГТФ;
6) Mg2+;
7) факторы инициации (IF-1, IF-2, IF-3).
На стадии инициации требуется разместить рибосому на 5’-конце мРНК и связать с инициирующим кодоном антикодон формилметионин-тРНК. Этот процесс включает следующие этапы:
1. 30S субъединица рибосомы связывается с 2-мя факторами инициации IF-1 и IF-3. Фактор IF-3 препятствует объединению 30S и 50S субъединиц рибосом с образованием непродуктивного 70S комплекса. К малой субъединице присоединяется мРНК.
Расположение инициирующего кодона мРНК (5’)АУГ определяется специфической последовательностью Shine-Dalgarno в мРНК. Эта последовательность состоит из 4-9 пуриновых нуклеотидов и располагается на расстоянии 8-13 нуклеотидов от инициирующего кодона. Нуклеотиды этой последовательности образуют водородные связи с комплементарными пиримидиновыми нуклеотидами вблизи 3’-конца 16S рРНК в 30S субъединице рибосомы. Взаимодействие мРНК-рРНК определяет расположение инициирующего кодона мРНК в 30S-субъединице рибосомы, где начинается трансляция.
2. Комплекс, состоящий из 30S субъединицы, IF-3 и мРНК связывается с комплексом ГТФ-IF-2 и инициирующей N-формилметионин-тРНК. Антикодон тРНК образует водородные связи с инициирующим кодоном тРНК.
3. Образовавшийся комплекс взаимодействует с 50S-субъединицей рибосомы. Белковый фактор IF-2 способствует соединению малой и большой субъединиц рибосом. После присоединения большой субъединицы рибосом происходит гидролиз ГТФ и высвобождение всех факторов инициации – IF-1, IF-2, IF-3.
Полностью собранная рибосома содержит 3 функциональных участка, образованных благодаря специфическому сочетанию областей 30S и 50S субъединиц рибосом.
Пептидильный участок (Р-участок) имеет сродство к пептидам и содержит в процессе синтеза растущую полипептидную цепь. Аминоацильный участок (А-участок) содержит аминоацил-тРНК, соединенную с соответствующим кодоном мРНК. Е-участок является местом в 50S субъединице, откуда тРНК покидают рибосому во время элонгации.
Фактор инициации IF-1 связывается с А-участком и предотвращает присоединение к нему аминоацил-тРНК во время инициации синтеза полипептидной цепи.
N-Формилметионин-тРНК является единственной аминоацил-тРНК, которая связывается с Р-участком; во время элонгации остальные аминоацил-тРНК связываются вначале с А-участком и затем переходят в Р-участок и Е-участок.
В результате стадии инициации синтеза полипептидной цепи образуется функциональная 70S рибосома, которая называется инициаторным комплексом.
Инициация у эукариот. Механизм трансляции у эукариот аналогичен трансляции у бактерий и основные различия касаются стадии инициации. Эукариотические мРНК связываются с рибосомой в виде комплекса со специфическими ферментами. Полагают, что некоторые из них связывают вместе 3′ и 5′ концы мРНК. 3′ конец мРНК связывается белком, который называется поли(А)-связывающий белок (poly(A) binding protein, РАВ). Эукариотические клетки имеют не менее 9 факторов инициации.
9.6.3.3. Стадия III – элонгация полипептидной цепи
Необходимые компоненты для элонгации:
1) инициаторный комплекс, образованный на предыдущей стадии;
2) полный набор аминоацил-тРНК;
3) Mg2+;
4) факторы элонгации (EF-Tu,EF-Ts и EF-G у бактерий);
5) пептидилтрансфераза.
6) ГТФ
Цикл элонгации включает 3 этапа: 1) связывание аминоацил-тРНК; 2) образование пептидной связи; 3) траслокацию.
1 этап – связывание аминоацилтРНК. Фактор элонгации EF-Tu образует комплекс с ГТФ, который связывается со всеми аминоацил-тРНК в цитоплазме. Тройной комплекс, аминоацил-тРНК–EF-Tu·ГДФ, взаимодействует антикодоном с кодоном мРНК в А-участке рибосомы по принципу комплементарности. Фактор элонгации EF-Tuобладает ГТФ-азной активностью и гидролизует ГТФ. Комплекс EF-Tu·ГДФ уходит из 70S рибосомы. Комплекс EF-Tu·ГТФ восстанавливается при помощи EF-Ts и ГТФ.
2 этап – образование пептидной связи. Пептидная связь образуется между двумя аминокислотами, которые связаны с тРНК в А- и Р-участках рибосомы. Происходит перенос инициирующей N-формилметионильной группы от тРНК на аминогруппу второй аминокислоты, находящейся в А-участке. α-Аминогруппа аминокислоты в А-участке действует как нуклеофильная группа, замещая тРНК в Р-участке для образования пептидной связи. В результате образуется дипептидил-тРНК в А-участке и деацилированная тРНК остается связанной с Р-участком. Образование пептидной связи катализируется ферментом пептидилтрансферазой(составная часть 50S субъединицы рибосомы)
3 этап - транслокация. При участии фактора EF-G (транслоказа) и за счет энергии ГТФ происходит процесс транслокации – рибосома перемещается на один кодон мРНК в направлении 5′→3′, пептидил-тРНК перемещается в Р-участок, а тРНК из Р-участка перемещается в Е-участок, а затем высвобождается в цитозоль. В результате транслокации в А-участок рибосомы приходит следующий новый кодон мРНК. К нему методом случайного подбора присоединяется комплементарная аминоацил-тРНК. Между дипептидом Р-участка и аминокислотным остатком в А-участке замыкается пептидная связь. Образующийся трипептид транслоцируется в Р-участок, а в А-участок приходит следующий новый кодон мРНК и т.д. Таким образом, процесс повторяется пока в Р–участок не придет один из терминирующих кодонов.
Элонгационный цикл у эукариот подобен циклу у прокариот. Факторы элонгации eEF1α, eEF1βγ и eEF2 выполняют функции аналогичные функциям EF-Tu, EF-Ts EF-G, соответственно. Эукариотические рибосомы не имеют Е-участка. Ненагруженная тРНК
9.6.3.4. Стадия IV – терминация
Необходимые компоненты стадии:
1) АТФ;
2) терминирующий (нонсенс-кодон);
3) факторы терминации (релизинг-факторы) – RF1, RF2 и RF3;
4) пептидилтрансфераза;
1. После многих циклов элонгации, в результате которых синтезируется полипептидная цепь белка, в А-участке появляется терминирующий или нонсенс-кодон (УАА, УАГ, УГА).
2. В норме отсутствуют молекулы тРНК, способные узнавать нонсенс-кодоны. Факторы терминации узнают данные кодоны: RF1 узнает кодоны УАА и УАГ, RF2 – УАА и УГА.
3. Связывание релизинг-фактора с терминирующим кодонам в А-участке активирует пептидилтрансферазу, которая гидролизует связь между полипептидом и тРНК в Р-участке. После гидролиза и высвобождения синтезированного полипептида и тРНК рибосома диссоциирует на малую и большую субъединицы, готовых к синтезу новой полипептидной цепи.
Специфическая функция RF3 установлена неточно и предполагают, что он участвует в диссоциации рибосомы на субъединицы.
У эукариот в терминации участвует фактор еRF, который узнает все три кодона терминации.