Методы количественного определения белков
РАБОТА 3. КОЛИЧЕСТВЕНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ
Цель работы: ознакомиться с одним из распространённых методов количественного определения белка в сыворотке крови.
Задачи:
· построить калибровочную кривую по стандартным растворам белка;
· определить содержание белка в предложенной сыворотке крови;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Белки в щелочной среде реагируют с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.
Ход работы
1. Построение калибровочной кривой
Готовят семь рабочих стандартных растворов белка разведением основного стандартного раствора (содержит 4 мг белка в 1 мл) дистиллированной водой, как указано в таблице.
| №проб | Стандартный раствор, мл | Н2О, мл | Содержание белка в пробе, мл | Еср |
| 0,25 | 1,75 | 1,0 | ||
| 0,50 | 1,50 | 2,0 | ||
| 0,75 | 1,25 | 3,0 | ||
| 1,00 | 1,00 | 4,0 | ||
| 1,25 | 0,75 | 5,0 | ||
| 1,50 | 0,50 | 6,0 | ||
| 1,75 | 0,25 | 7,0 | ||
| Контроль | - | 2,00 | - | - |
| Сыворотка | - | - |
Во все рабочие стандартные растворы и контроль добавляют по 2,5 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут для развития окраски. Окрашенные стандартные растворы колориметрируют на ФЭКе против контроля в кюветах на 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм). Полученные значения оптической плотности используют для построения калибровочной кривой.
2. Количественное определение белка в сыворотке крови
Исследуемую сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (1 мл цельной сыворотки смешивают с 39 мл Н2О).
К 2 мл разбавленной сыворотки добавляют 2,5 мл биуретового реактива и после перемешивания оставляют при комнатной температуре на 30 минут, а затем колориметрируют. Измерение оптической плотности производят так же, как при построении калибровочной кривой (используют тот же контроль, что и для построения калибровочной кривой). Содержание белка в пробе определяют по калибровочной кривой.
Результаты:
Калибровочная кривая
Х = (А / 2 × 40 × 100) / 1000 = А × 2 (г%),
где А – количество белка в пробе, определённое по калибровочной кривой,
А/2 – количество белка (мг) в 1 мл разбавленной в 40 раз сыворотки крови,
100 – для пересчёта на 100 мл сыворотки (для выражения показателя в мг%),
1000 – для перевода единиц в г%.
В сыворотке крови здорового человека содержится 6,5-8 г% белка.
Выводы:
РАБОТА 4. определение концентрации гемоглобина
в крови колориметрическим (унифицированным) методом
Цель работы: ознакомиться с современным, применяемым в клинической практике, методом количественной оценки содержания гемоглобина в крови.
Задачи:
· освоить унифицированный метод определения содержания гемоглобина в эритроцитарной взвеси, полученной из крови человека;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Под действием феррицианида калия и цианида гемоглобин трансформируется в цианометгемоглобин, определяемый фотометрически.
Ход работы. С помощью автоматических пипеток в пробирку вносят 2 мл рабочего реагента и 0,01 мл крови. Через 5 минут пробы колориметрируют на ФЭКе против рабочего реагента в кюветах с толщиной поглощающего слоя 3 мм при длине волны 520-560 нм.
В норме содержание гемоглобина у мужчин колеблется в пределах 13,2-16,4 г%, женщин – 11,5-14,5, детей – 11,5-14,5 и новорожденных – 15-24 г%.
Результаты:
Концентрацию гемоглобина (С) рассчитывают в г% (в г на 100 мл крови):
С = Еоп × 62,8 (г%),
где: Еоп – экстинкция пробы.
Для выражения концентрации гемоглобина в г/л результат умножают на 10.
Выводы:
РАЗДЕЛ 2. ФЕРМЕНТЫ
РАБОТА 5. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ
Цель работы: ознакомиться с каталитическим действием некоторых ферментов пищеварительного тракта (амилазы слюны, пепсина и липазы) и каталазы крови.
Задачи:
· проделать предложенные реакции;
· написать уравнения реакций, катализируемых исследуе-мыми ферментами;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
Ферменты (энзимы) – простые и сложные белки, катализирующие определённые химические реакции в организме. Так, амилаза слюны катализирует гидролиз α-1,4-глюкозидных связей крахмала и гликогена, что приводит к образованию декстринов, а затем мальтозы. Панкреатическая липаза превращает ацилглицерины в глицерол и жирные кислоты. Фермент желудочного сока пепсин ускоряет гидролитический распад белков до пептидов. Каталаза расщепляет пероксид водорода на воду и молекулярный кислород.
При ознакомлении с действием фермента сравнивают результаты энзиматической реакции с контрольными пробами, полученными в отсутствие фермента.
1. Ознакомление с действием амилазы слюны
Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны, а в другую (контроль) – 0,5 мл дистиллированной воды. Содержимое каждой пробирки перемешивают, и пробы помещают в термостат при 37˚С на 15 минут. Затем в обе пробирки добавляют по 1-2 капли раствора Люголя (раствор йода в растворе KI). В контрольной пробирке появляется синее окрашивание, а в опытной (с амилазой слюны) такая окраска не развивается.
Уравнение реакции действия амилазы слюны на крахмал:
2. Ознакомление с действием липазы
Ход работы. В две пробирки наливают по 4 мл дистиллированой воды, 5 мл 1%-го раствора бикарбоната натрия и 1 мл растительного масла. Содержимое пробирок энергично встряхивают до образования эмульсии и в обе пробирки добавляют по 3 капли 0,5%-го спиртового раствора фенолфталеина. Затем в одну пробирку приливают 1 мл раствора липазы, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Содержимое снова энергично встряхивают и пробирки ставят в термостат при 37˚С на 15-20 минут. В пробирке с липазой раствор становится менее окрашенным или обесцвечивается, в контрольной - остается розовым.
Уравнение реакции действия панкреатической липазы на триацилглицеролы (ТАГ):
3. Ознакомление с действием пепсина
Ход работы. В две пробирки наливают по 2 мл 1%-го раствора альбумина и денатурируют его нагреванием. Пробирки охлаждают до комнатной температуры, а затем в одну из них добавляют 1 мл раствора пепсина, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Обе пробы помещают в термостат при 37˚С на 15 минут. В пробирке с ферментом муть исчезает.
Уравнение реакции действия пепсина на альбумин:
4. Ознакомление с действием каталазы
Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл свежеприготовленного 5%-го раствора перекиси водорода и в одну из них добавляют 1 каплю крови, в которой содержится фермент каталаза. В пробирке с каталазой наблюдается интенсивное выделение пузырьков кислорода.
Уравнение реакции разложения перекиси водорода каталазой:
Выводы:
РАБОТА 6. изучение свойств ферментов. Влияние на активность фермента реакции среды
и температуры, Субстратная специфичность
Цель работы: на примере амилазы слюны ознакомиться с некоторыми специфическими свойствами ферментов.
Задачи:
· проделать необходимые реакции;
· проанализировать полученные результаты и сформулиро-вать выводы;
· написать уравнения реакций каталитического расщепле-ния крахмала амилазой слюны.
Скорость ферментативных реакций зависит от температуры и концентрации водородных ионов в среде. Каждый фермент имеет свой оптимум рН и температуры, при которых активность фермента максимальна.
1. Влияние температуры на активность амилазы
Ход работы. В три пробирки вносят по 1 мл разбавленной в 10 раз слюны, одну из них помещают в термостат с температурой 37˚С, вторую – в кипящую водяную баню и третью – в лёд. Через 5 минут во все пробирки добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, перемешивают. Первую и вторую пробирки помещают в термостат, а третью – в прежние условия (лёд). Через 10 минут во все пробы добавляют по 3 капли раствора Люголя и перемешивают. Сравнивают окраску растворов и объясняют причину выявленных различий.
2. Определение оптимума рН активности амилазы
Ход работы. Перед началом работы готовят раствор амилазы разведением слюны в 10 раз. Для этого собирают 0,5 мл слюны в мерную пробирку, добавляют 4,5 мл дист. Н2О и раствор тщательно перемешивают стеклянной палочкой.
В восемь пронумерованных пробирок наливают по 2 мл фосфатного буферного раствора соответственно с рН 5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 6,8; 7,0; 7,4; 8,0. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,4%-го раствора крахмала (приготовленного на 0,1% растворе NaCl) и содержимое перемешивают стеклянной палочкой.
Затем быстро добавляют («веером») по 0,5 мл разведенной в 10 раз слюны, сначала в 5- и 4-ю пробирки, затем в 3-ю и 6-ю, далее во 2-ю и 7-ю и, наконец, в 1-ю и 8-ю пробирки. После добавления слюны содержимое каждой пробирки сразу же перемешивают. Отмечают время перемешивания раствора в 5-й пробирке, пробы помещают в термостат (37˚С).
Через 2-3 минуты 1 каплю жидкости из 5-й пробирки переносят стеклянной палочкой на предметное стекло и добавляют 1 каплю раствора Люголя. Если жёлтая капля Люголя окрашивается в синий или красно-коричневый цвет, то выжидают ещё 2 минуты и снова повторяют реакцию на наличие крахмала с каплей раствора из 5-й пробирки. Реакцию на предметном стекле повторяют через каждые 2 минуты до появления оранжево-красного или жёлто-коричневого цвета. После этого реакцию во всех пробирках быстро останавливают, приливая во все пробирки по 5 капель раствора Люголя, перемешивают и сравнивают окрашивание.
Оптимальное значение рН действия для амилазы определяют по пробирке с самым светлым (светло-жёлтым) окрашиванием.
Примечание. При низкой комнатной температуре после добавления слюны пробы помещают в термостат при 37˚С, периодически (через 2-3 минуты) проверяя раствор в 5-й пробирке на наличие крахмала.
3. Специфичность действия амилазы
Одним из свойств ферментов является специфичность их действия. Ферменты специфичны по отношению к типу катализируемой реакции и к субстрату, на который они действуют. Высокая специфичность ферментов определяется тем, что только строго определённые функциональные группы активного центра фермента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса. Амилаза обладает относительной специфичностью, гидролизуя α-1,4-гликозидные связи в крахмале и других соединениях, имеющих такой тип связи.
Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5 мл слюны и в одну из них добавляют 2 мл 0,5%-го раствора крахмала, а в другую – 2 мл 0,5%-го раствора сахарозы. Содержимое каждой пробирки перемешивают стеклянной палочкой, и пробы помещают в термостат при 37˚С на 20 минут. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия, по 0,5 мл 5%-го раствора сульфата меди и после перемешивания нагревают до кипения. В пробирке, содержащей крахмал, выпадает красный или жёлтый осадок (положительная проба Троммера).
Выводы:
РАБОТА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИНОТРАНСФЕРАЗ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО МЕТОДУ КИНГА
Цель работы: ознакомиться с одним из методов колориметрического определения активности аминотрансфераз, широко используемых в медицинской практике для выявления заболеваний.
Задачи:
· ознакомиться с предложенным методом определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови;
· провести анализ и сделать выводы.
Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз) крови имеет большое диагностическое значение. Например, при инфаркте миокарда в крови увеличена активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ), при инфекционном гепатите – активность аланинамино-трансферазы (АлАТ). Кроме того, в клинической практике рассчитывают коэффициент де Ритиса (АсАТ/АлАТ), который в норме составляет 1,33±0,42. При сердечно-сосудистых патологиях коэффициент увеличивается, а при печёночных – уменьшается.
Принцип метода. Метод Кинга основан на способности аланин- и аспартаттрансаминаз конденсировать 2,4-динитрофенилгидразин и продукты дезаминирования аминокислот - пировиноградную и щаве-левоуксусную кислоты:
Ход работы. В одну пробирку (опытная проба) вносят 0,2 мл сыворотки крови, в другую (контрольная проба) - 0,2 мл дистиллированной воды; в обе пробирки добавляют по 0,5 мл 2%-го раствора аспарагиновой кислоты и по 0,5 мл 0,6%-го раствора α-кето-глутаровой кислоты. Пробы перемешивают и помещают на 60 минут в термостат (37˚С), после чего каталитическое действие фермента останавливают добавлением в обе пробы по 1 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина и вновь помещают в термостат на 15 минут. Затем добавляют по 10 мл 0,4 н раствора NaOH и оставляют на 1-2 минуты до появления окраски. Пробы колориметрируют на ФЭКе с зелёным светофильтром в кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Активность аминотрансфераз выражают в условных единицах, умножая оптическую плотность на 100.
У здоровых людей активность аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови составляет 10-35 единиц.
Результаты:
Выводы:
РАЗДЕЛ 3. ВИТАМИНЫ
РАБОТА 8. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И МОЧЕ
Цель работы: ознакомиться с одним из методов количественного определения витамина в пищевых продуктах и биологических объектах.
Задачи:
· определить содержание витамина С в пищевых продуктах и моче;
· сравнить полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Метод основан на способности витамина С восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол:
2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой среде – красную, в восстановленном состоянии – бесцветную:
При определении количества витамина С исследуемый раствор, подкисленный соляной кислотой, титруют 2,6-дихлорфенолиндофено-лятом натрия. Как только всё количество витамина С, имеющееся в исследуемом растворе, окислится, раствор приобретает розовую окраску, характерную для 2,6-дихлорфенолиндофенола в кислой среде.
1. Определение количества витамина С в пищевых продуктах
Аскорбиновая кислота не синтезируется в организме человека. Основным источником этого витамина являются, в основном, свежие овощи и фрукты. В различных пищевых продуктах содержится следующее количество витамина С (в мг%):
чёрная смородина – 100-400;
укроп – 120-135;
лимон – 40-55;
капуста (свежая и квашеная) – 30-40;
томаты – 20-40;
лук зелёный – 16-33;
яблоки северные – 20-40;
яблоки южные – 5-17;
смородина красная – 5-15;
картофель – 7-10;
бананы – 7-10;
печень – 20-50;
селезёнка – 20-50;
кумыс – 20-25.
Источником витамина С может быть хвоя ели и сосны, содержащая 150-250 мг% (иногда до 400 мг%) аскорбиновой кислоты.
А. Определение содержания витамина C в плодах шиповника
Ход работы
а) гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С. 1 г сухих плодов измельчают в фарфоровой ступке с 2 мл дистиллированной воды, смесь количественно переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объём водой до метки. Через 10 минут смесь фильтруют через бумажный фильтр в мерную пробирку.
б) количественное определение витамина C в экстракте. К 2 мл полученного фильтрата добавляют 2-3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Содержимое переливают в колбочку на 50 мл и титруют 0,001н раствором 2,6-дихлорфенолиндо-фенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
в) расчёт:
Х = (0,088 × А × 25 × 100) / Б × В (мг%),
где А – количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (в мл), пошедшее на титрование;
В – количество сухого вещества в г, взятое для анализа;
Б – количество вытяжки в мл, взятое для титрования;
25 – общее количество вытяжки в мл;
0,088 – количество аскорбиновой кислоты в мг, эквивалентное 1 мл 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.
Б. Определение содержания витамина С в пищевых продуктах
Ход работы
а) гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С. Этот этап работы выполняют так же, как в предыдущем случае (при определении содержания аскорбиновой кислоты в шиповнике).
б) количественное определение витамина C в экстракте. 10 мл фильтрата приливают в колбочку на 50 мл, подкисляют 2-3 каплями 10%-го раствора соляной кислоты и титруют так же, как в предыдущем случае.
в) расчёт делают по той же формуле, что и при определении витамина C в шиповнике, только количество вытяжки (Б), взятое для титрования, будет равно 10 мл.
Примечание: если исходный цвет фильтрата сильно окрашен (например, у моркови или петрушки), берут 2 мл фильтрата и 8 мл дистиллированной воды, но это учитывают при расчётах.
2. Определение содержания витамина С в моче
Ход работы. В коническую колбу вносят 10 мл мочи и 10 мл дистиллированной воды. Добавляют 1 мл концентрированной уксусной кислоты и титруют 0,001н раствором 2,6-дихлорфенолиндо-фенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
Расчёт:
Х = (0,088 × А × 100) / 10 (мг %),
где А – количество 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола в мл, пошедшее на титрование;
10 – количество мочи в мл, взятое на титрование;
100 – коэффициент для выражения результата в мг %;
0,088 – эквивалент аскорбиновой кислоты.
Выводы:
Й семестр