Выделение вирусов и методы их индикации в культуре клеток

Для заражения используются чувствительные к данному вирусу культуры с хорошо развитым монослоем клеток, находящиеся в пробирках (флаконах).

Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку (лунку планшета или флакон) вносят по 0,1-0,2мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками. После 30 - 60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят по 1,0 - 1,5мл на пробирку поддерживающей среды и оставляют в термостате до выявления признаков репродукции вирусов.

ФЕНОМЕНЫ, ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ВЫЯВИТЬ ВИРУС В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

1. Цитопатический эффект (действие) – (ЦПЭ или ЦПД), который является следствием поражения клеток под действием размножающегося в них вируса.

ЦПД может быть трех основных типов:

а) кругло- или мелкоклеточная дегенерация;

б) образование гигантских многоядерных клеток - симпластообразование;

в) образование внутриядерных или цитоплазматических включений вирусспецифических или неспецифических.

Феномен гемадсорбции (РГадс)

Принцип метода: контакт клеток с эритроцитами приводит к адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, пораженных вирусом с гемагглютинирующими свойствами. Эффект можно увидеть при малом увеличении микроскопа (х80).
положительная	отрицательная

Образование бляшек - феномен Дюльбекко

Принцип метода: монослой клеток после заражения вирусомзаливаютслоем полужидкого агара, в состав которого входит питательная среда и краситель нейтральный красный. В тех зонах монослоя, где происходит размножение цитопатического вируса, группы разрушенных клеток не закисляют среду, выглядят на розовом фоне прозрачными пятнами.

Феномен интерференции

Принцип метода: феномен интерференции используется для обнаружения вирусов, не дающих отчетливого ЦПД в культуре клеток. Исследуемую культуру повторно заражают вирусом, регулярно вызывающим ЦПД. Индикаторным является ВВС - вирус везикулярного стоматита. При наличии в исследуемом материале нецитопатогенного вируса ЦПД у индикаторного ВВС также будет отсутствовать (клетка "занята" исследуемым вирусом).

3) ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ

Используют преимущественно новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражение животных проводится по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные - интрацеребрально, дерматотропные - на кожу. Индикация вируса основана на проявлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических изменениях в тканях и органах, а также на положительной реакции гемагглютинации с экстрактами из органов.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД.

а). Для ранней диагностики заболевания определяют наличие IgM в сыворотке с помощью ИФА или непрямой РИФ.

б). В серодиагностике вирусных инфекций используют подход «парных сывороток», что позволяет определить нарастание титра (прирост антител) за определенный период заболевания с помощью набора вирусных диагностикумов. Парные сыворотки - две сыворотки, взятые от одного больного в начале заболевания и через 1-4 недели. Серологические реакции (РПГА, РСК, РТГА, РН, ИФА и др.) ставят одновременно с двумя сыворотками для определения и сравнения их титров.

Диагностически значимым считают нарастание титра в 4 и более раз.

ОСНОВНЫЕ СЕМЕЙСТВА ВИРУСОВ (контрольная)

ДНК- содержащие

Простые (без оболочек) ДНК- содержащие вирусы 1.Аденовирусы Adenoviridae 2-х нитчатая ДНК 2.Папилломавирусы Papillomaviridae 2-х нитчатая ДНК 3.Полиомавирусы Poliomaviridae 2-х нитчатая ДНК 4. Цирциновирусы Circinoviridae 1- нитчатая ДНК 5.Парвовирусы Parvoviridae 1- нитчатая ДНК

Сложные (с оболочками) ДНК- содерж. вирусы * Поксвирусы Poxviridae 2-х нитчатая ДНК * Герпесвирусы Herpesviridae 2-х нитчатая ДНК * Гепаднавирусы Hepadnaviridae 2-х нитчатая кольцевая ДНК с 1 нитчатым участком

РНК- содержащие

Простые (без оболочек) РНК- содержащие вирусы 1.Пикорнавирусы Picornaviridae 1-нитчатая РНК 2.Калицивирусы - Caliciviridae - 1-нитчатая РНК 3.Астровирусы - Astroviridae - 1-нитчатая РНК 4.Реовирусы - Reoviridae - 2-нитчатая РНК фрагментированная

Сложные (с оболочками) РНК- содержащие вирусы *Ортомиксовирусы Orthоmyxoviridae 1-нитч.РНК *Парамиксовирусы Paramyxoviridae 1-нитч. РНК *Тогавирусы Togaviridae 1-нитчатая РНК *Рабдовирусы Rhabdoviridae 1-нитчатая РНК *Филовирусы Filoviridae 1-нитчатая РНК *Флавивирусы Flaviviridae 1-нитчатая РНК *Ретровирусы Retroviridae 1-нитчатая РНК *Аренавирусы Arenaviridae 1-нитчатая РНК *Коронавирусы Coronaviridae 1-нитчатая РНК *Буньявирусы Bunyаviridae 1-нитчатая РНК

ДЕМОНСТРАЦИИСреды для культивирования клеток: среда 199, раствор Хенкса, сыворотка, гидролизат лактальбумина, трипсин, раствор Версена, лейкоцитарный интерферон.