Бактериофаг

Вирус, паразитирующий на бактериальных клетках, называют бактериофагом. По греч. phagein – пожирать, выражается в лизисе (растворении) бактериальных клеток. Бактериофаг имеет головку, в которой заключены ДНК или РНК и хвост с отростками.

Известны вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные бактериофаги могут лизировать бактерии с образованием новых фаговых частиц. ДНК умеренных фагов включаются в хромосому бактериальной клетки и передаются по наследству, придавая клетке-хозяину новые свойства. Такое взаимодействие фага с клеткой называют лизогенией, а бактерии, несущие умеренные фаги, называют - лизогенными.

Действие фага строго специфично. Феномен действия вирулентных фагов проявляется просветлением взвеси бактерий в жидкой среде или отсутствием роста бактерий при посеве их на плотную среду газоном.

Большинство фагов проявляет видоспецифичность в отношении бактерий, хотя имеются и вариантные фаги, для определения фаговаров внутри вида бактерий.

На практике фаги применяют для:

1. маркировки культур при эпидемиологическом расследовании, определение фаговара,

2. диффренцировки бактериальных культур, установление видовой принадлежности,

3. фагодиагностики - выделение фага из фекалий больного,

4. фаготерапии - в отдельных случаях фаги применяют для лечения инфекционных заболеваний.

Метод титрования бактериофага:

1. Метод Аппельмана (серийных разведений).

Испытуемый фильтрат или известный бактериофаг разводят 10-ти кратно МПБ. Берут 10 пробирок с 4,5 мл МПБ в каждой. В первую вносят 0,5 мл исследуемого фага, содержимое перемешивают и 0,5 мл жидкости переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают содержимое и таким же образом переносят во все следующме пробирки. Получают разведения бактериофага от 10^-1 до 10^-8. В каждую пробирку, включая контроль, вносят по одной капле культуры, выросшей на МПБ. Для контроля берут 2 пробирки с МПБ, в одну вносят 0,5 мл исследуемого фага (контроль на отсутствие бактерий в исследуемом фаге), в другую пробирку - одну каплю микробной культуры (контроль культуры). Все пробирки инкубируют при 37⁰ С в течение 18 ч. Титр фага определяют по наибольшему разведению препарата, в котором обнаруживается литическая активность.

2. Метод Грациа (агаровых слоев).

В 5 чашек Петри заливают 1,5 % МПА с индикатором генцианвиолетом (0,1 мл 0,4 % раствора на 1 л среды). Агар в чашках подсушивают в термостате до полного удаления конденсата.

Готовят разведения исследуемого фага на физиологическом растворе от 10^-2 до 10^-9.

Готовят 5 пробирок, содержащих 0,7 % МПА в количестве 2,5 мл, расплавляют его на водяной бане и охлаждают до 45-50⁰ С. Во все пробирки с МПА вносят 0,1 мл 1 млрд взвеси эталонной суточной культуры и в каждую из пробирок добавляют по 1 мл одного из разведений – 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8 испытуемого фага, перемешивают и добавляют во все пробирки по 2,5 мл 0,7 % МПА, охлажденного до 50^О С. Содержимое пробирок перемешивают и из каждой пробирки смесь вносят вторым слоем в соответствующую чашку с МПА по принципу одна пробирка – одна чашка. Смесь равномерно распределяют по поверхности агара в чашке и оставляют на 50 мин до полного охлаждения агара. Затем чашку слегка подсушивают и инкубируют при 37⁰ С в течение 18-20 ч.

На фоне равномерного роста бактерий отмечают пятна, где рост бактерий отсутствует, что обусловлено лизисом микробной культуры в результате действия бактериофага. При большом количестве бактериофага наступает лизис по всей поверхности агара, при меньших разведениях бактериофага наблюдаются отдельные зоны просветлений, в последней чашке (10^-8) зоны просветления отсутствуют. При определенном допуске, что каждый участок лизиса образован в результате действия одной частицы фага, то можно подсчитать в 1 мл препарата количество активных частиц фага. Допустим, что имеется 30 фаговых пятен, при разведении 10^-7 степени. Следовательно, титр фага равен 3х10^-8, т.е. в 1 мл фага содержится 3х10⁸ активных корпускул фага.

3. Титрование фага на твердых средах.

Растирают шпателем 1-2 капли молодой агаровой культуры по всей поверхности агара, дают подсохнуть и на разные сектора чашки наносят по 1 капле разных разведений фага, который исследуют. Предварительно, со стороны дна чашки маркируют сектора с фагом. После 18-24 ч инкубирования в термостате следует определять результаты. Титром считают максимальное разведение фага, которое вызвало полный лизис бактерий на данном секторе среды. Метод можно проводить параллельно с исследованием Аппельмана.

Метод выделения бактериофагов

Для выделения бактериофагов из объектов внешней среды готовят фильтрат исходного материала, для чего 3-5 г фекалий размешивают в 50 мл МПБ и инкубируют полученную взвесь при 37⁰ С в течение 18-20 ч. Далее взвесь очищают от взвешенных частиц, путем фильтрования. Освобождение фага от бактерий достигается за счет фильтрования через свечи или асбестовые пластинки. Корпускулы бактериофагов проходят через такой фильтр и обнаруживаются в фильтрате.

Метод фаготипирования бактерий

Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательной среды в чашке Петри. Делят площадь чашки на квадраты (карандашом на дне чашки) и подписывают бактериофаг, который с помощью пастерки наносят на квадрат по одной капле. После инкубации 18-24 ч отмечают на чашке те квадраты, в которых имеется сплошной лизис бактерий.

Фаготип культуры определяется тем типом фага, который вызвал лизис данного штамма.

Специфичность бактериофагов определяют методами Отто и Фюрта.

1. Метод Отто. Растопленный 3 % мясо-пептонный агар разливают в стерильные чашки Петри, охлаждают, подсушивают в термостате 10-15 мин. Газоном засевают на чашки 16-18 ч бульонную культуру разных бактерий. Наносят каплю известного фага ближе к одной из сторон чашки, затем чашку наклоняют и дают капле фага стечь до противоположного края чашки. Чашки инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 ч и затем учитывают результат. Если фаг гомологичен бактериям в определенной чашке и биологически активен, то по пути стекания капли фага роста бактерий в этой чашке не будет, среда останется прозрачной.

2. Метод Фюрта. В 15-30 мл МПБ вносят 0,5 мл фекалий и помещают в термостат при 37⁰ С на 24 ч. На другой день МПБ фильтруют через свечу и полученный фильтрат заливают 1,5 % МПА, охлажденным до 50⁰ С. Фильтрат тщательно смешивают с агаром и заливают в чашку Петри, когда агар остынет, подсушивают в термостате.

Дно чашки делят на 8-10 секторов и на каждый из них засевают штрихом бульонную культуру бактерий 3 ч возраста. Чашки ставият в термостат на 37^о С. Результат учитывают через 18-24 ч экспозиции при 37^о С. Если в исследуемом фильтрате есть бактериофаг, то гомологичный микроорганизм на среде расти не будет или только путем отдельных колоний. На секторах, куда засеяли бактерии гетерогенные бактериофагу, будет нормальный рост микробов.

По модификации Фишера, дно чашки делят пересекающимися линиями на тридцать квадратов. В центр каждого квадрата вносят исследуемые бульонные культуры. Результат учитывают через 18-24 ч инкубирования в термостате.