Тема: Структура и свойства белков. Методы выделения и очистки белков. Нарушения белкового состава сыворотки крови

Лабораторный практикум №1

Цели занятия: Сформировать у студентов знание о структуре белков, уровнях организации белковых молекул, классификациях и биологической роли белков в организме человека. Познакомить студентов с методами анализа белков, основанными на их физико-химических свойствах, а также с методами количественного определения белков в биологических жидкостях и диагностическим значением этих методов. Сформировать у студентов навыки работы с рефрактометром и ФЭК-ом, умения анализировать протеинограммы и использовать полученные данные для диагностики заболеваний.

Белки, являясь одним из основных компонентов организма, присутствуют во всех биологических жидкостях. Анализ количественного и качественного состава белков, циркулирующих в крови, позволяет оценить не только состояние обмена белков в организме, но и предположить нарушение функции отдельных органов и систем. Изменение соотношения отдельных белковых фракций плазмы крови имеет место при целом ряде физиологических и патологических состояний. Определение общего количества белка в сыворотки крови, а также оценка соотношения отдельных белковых фракций, имеет важное диагностическое значение.

Хронометраж практического занятия:

1. Вводная беседа. Тестирование исходного уровня знаний— 15 мин.

2. Практическая часть – обсуждение теоретического материала, знакомство с методами анализа белка. Решение ситуационных задач – 45 мин.

4. Лабораторная работа– определение общего белка сыворотки крови по интенсивности окраски с биуретовым реактивом, анализ готовых хроматограмм аминокислот- 65 мин.

5. Контроль выполнения лабораторной работы, подведение итогов занятия — 10 мин.

Продолжительность занятия — 3час(леч), 4 часа(пед)

Методическое и материально-техническое оснащение(химическая посуда, биологический материал, ФЭК, рефрактометр (для демонстрации), набор разных хроматограмм аминокислот для анализа)

Содержание темы:Белки – определение, роль в организме. Коротко повторить строение белков: альфа-аминокислоты, пептидная связь. Уровни организации белковой молекулы. Роль простетической группы. Конформация белка, доменное строение и их значение в функционировании белков. Физико-химические свойства белков (растворимость и осаждаемость, оптические и электрические свойства). Роль высших уровней организации белковых молекул (третичной и четвертичной структуры) в функционировании белков. Методы выделения, фракционирования очистки белков, основанные на физико-химических особенностях белковых молекул. Методы определения концентрации белка в биологических жидкостях: рефрактометрический, колориметрический. Нормальное содержание белка в сыворотке крови у детей в разные возрастные периоды и у взрослых. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови на бумаге и других носителях. Принципы методов. Нормы. Диагностическое значение.

Базисные знания: Из курса органической химии студент должен знать и уметь писать структурные формулы протеиногенных аминокислот и пептидов; иметь представление о классификации аминокислот и белков, а также о физико-химических свойствах их (растворимость и осаждаемость, оптические и электрические свойства). Студент должен знать уровни организации белковой молекулы, характеристики связей, стабилизирующих первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры белков, биологическую роль аминокислот и белков. Студент должен уметь качественно обнаружить белок (биуретовая реакция) и аминокислоты (нингидриновая реакция) в растворе.

Из курса физики студент должен знать устройство и принцип работы ФЭКа

Учебная карта занятия:

Вводная беседа. Кратко обсудить со студентами особенности структуры и уровни организации белковой молекулы в связи с физико-химическими свойствами и биологическими функциями белков. Ознакомить студентов с методами выделения, очистки и фракционирования белков, а также с методами количественного определения содержания общего белка в сыворотке крови и методом электрофоретического разделения белков сыворотки. Остановиться на диагностическом значении определения общего белка и его фракций. Познакомить студентов работой на ФЭКе и с методом построения и использованием калибровочного графика при колориметрических определениях. Дать краткую характеристику отдельных белковых фракций и индивидуальных белков, входящих в их состав. Обратить внимание на особенности нормальной протеинограммы в разные возрастные периоды у детей по сравнению со взрослыми (см. таблицу).

Возрастные особенности нормальных величин белков плазмы крови

№	Возраст	Общий белок (г/л)	Альбумины (%)	Глобулины(%)
	α-1	α-2	β	γ
1.	Пуповинная кровь	50 – 70	47 -69	2 – 5	3 – 11	6 – 14	14 – 24
2.	Новорожденные	47 – 65	49 – 71	2 – 5	5 – 11	5 – 13	13 -25
3.	6 месяцев	54 – 68	53 – 73	3 – 6	8 – 14	7 – 17	6 – 12
4.	12 месяцев	57 – 73	50 – 70	3 – 6	9 – 15	8 – 18	7 – 13
5.	Взрослые	65 -85	53 – 68	2 – 8	7 – 11	11 -15	12 -21

Отметить также, что резкое снижение количества белков плазмы в раннем детском возрасте – неблагоприятный симптом, который требует энергичного лечения. Продолжительная гипопротеинемия подавляет деятельность печени, нарушая обмен гликогена, процессы дезаминирования, декарбоксилирования, синтеза мочевины и других дезинтаксикационных процессов.

Вопросы для собеседования.

1. Белки. Определение. Биологическая роль. Классификация по структуре, по форме молекул, по физико-химическим свойствам.
2. Аминокислоты как структурные компоненты белковых молекул. Особенности структуры. Физико-химические свойства. Классификации аминокислот (по структуре радикалов, по биологической значимости). Цветная реакция на α-аминокислоты (нингидриновая проба). Принцип. Практическое применение
3. Уровни организации белковой молекулы. Первичная структура белков. Пептидная связь, ее характеристика. Принцип формирования пептидной связи. Биуретовая реакция – универсальная реакция на пептидную связь. Принцип. Практическая значимость. Гидролиз белка (кислотный, щелочной, ферментативный)
4. Вторичная, третичная, четвертичная структуры белков. Связи, стабилизирующие высшие уровни организации белковой молекулы. Биологическое значение уровней организации белковой молекулы.

1. Физико-химические свойства белков в связи со структурными особенностями. Факторы стабилизации белковых растворов (структурная организация, наличие заряда, наличие гидратной оболочки). Способы осаждения белков (обратимые – высаливание, изоэлектрическое осаждение; необратимые - денатурация). Практическое применение.
2. Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация). Принципы, практическое применение.
3. Хроматографические методы разделения белков (гель-хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография). Принципы методов. Практическое применение.
4. Метод количественного определения белка в сыворотке крови (практика). Принцип, норма, диагностическое значение. Возрастные особенности нормальных величин белков сыворотки крови.
5. Электрофорез белков сыворотки крови. Принцип, диагностическое значение. Особенности протеинограммы в детском возрасте. Диагностическое значение метода.

Теоретическая часть.

Разбор ситуационных задач:

• 1. С целью стерилизации различных объектов их обрабатывают формальдегидом. Что происходит при этом с белками?

• 2. Препараты, содержащие березовый деготь, обладают выраженным антимикробным действием. Предположите возможный механизм действия, исходя из того, что березовый деготь содержит в своем составе фенол.

• 3. Для профилактики инфекционных заболеваний контактным лицам вводят препарат из крови реконвалесцентов, содержащий антитела к данному заболеванию. Этот препарат называется гамма-глобулин. Как его получить из сыворотки крови? Как очистить от примесей?

4. Вам дали две пробирки с осажденным белком. Известно, что один осадок получен при действии сернокислого аммония, а второй – после добавления ТХУ. Как отличить их? В чем сходство и в чем отличие при действии этих агентов на белок?

5. Имеются пробирки с растворами: I концентрированной азотной кислоты

II 10% трихлоруксусной кислоты

III СuSO4 в10% NaOH

Опишите, какие процессы произойдут в каждой пробирке при добавлении в них раствора белка. Какие из этих реакций находят практическое применение?

6. Белки, осуществляющие транспорт молекул или ионов через мембрану, часто классифицируются как трансмембранные белки. Такие белки имеют в своей структуре область, заключенную в липидном бислое мембраны, и области, обращенные внутрь клетки (в цитоплазму) и во внеклеточное пространство. Исходя из классификации аминокислот по полярности радикала, предположите, какие аминокислоты должны преобладать в различных участках данного трансмембранного протеина.

7. Найдите, в какой зоне рН (нейтральной, кислой или щелочной) лежит ИЭТ полипептида, состоящего из следующих аминокислотных остатков: арг-гис-глу-цис. В каком направлении будет двигаться данный пептид при разделении пептидов методом электрофореза в буферном растворе с нейтральным значением рН? Как изменится заряд и направление движения пептида в электрическом поле, если в составе пептида аргинин заменить лейцином?

8. Известно, что употребление в пищу сырых яиц может вызвать гиповитаминоз витамина Н. В составе яиц содержится белок авидин, который способен взаимодействовать с витамином Н и препятствовать его всасыванию в желудочно-кишечном тракте. Объясните, почему вареные яйца таким эффектом не обладают.

9. Больной 35 лет поступил в гастро-энтерологическое отделение. При обследовании обнаружено: общий белок сыворотки крови 59 г/л. Альбуминов – 45%, α-1 глобулины - 11%, α-2 глобулины – 10%, β-глобулины – 12%, γ-глобулинов – 22%. Оцените полученные данные. Предположите диагноз. Обоснуйте предположение.

10. Содержание общего белка в сыворотке крови ребенка 6 месяцев 72 г/л. Это норма? Если нет, как называется это состояние? Какие причины могли привести к его развитию? Почему?

Практическая часть: