Гипохромный эффект

В подавляющем большинстве случаев изменение конформации белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров вызы­вает значительные изменения в ультрафиолетовых спектрах поглощения. На рис. 8. приведены спектры поглощения полиадениловой кислоты, находящейся в двух различных состояниях — в форме двойной спирали и в виде статистического клубка [5]. Из рисунка видно, что в данном случае происходит значительное изменение интенсивности поглощения, но соотно­шение интенсивностей пиков, их положение и сама форма спектра меняются незначительно. Этот результат характерен для всех биополимеров. Приведенный пример иллюстрирует общее правило, соглас­но которому интенсивность поглощения чрезвычайно сильно меняется, если она связана с квантовыми переходами электро­нов, сопровождающими изменение конформации молекулы. Если в результате конформационного изменения интенсивность поглощения уменьшается, то это явление называется гипохромным эффектом (гипохромизмом), а если, напротив, интен­сивность поглощения увеличивается, то это называется гиперхромным эффектом (гиперхромизмом). Эти эффекты, подобно круговому дихроизму и дисперсии оптического вращения, отражают изменения в конформации биополимеров и чрезвычайно широко используются для изучения механизмов биологических процессов. В настоящее время гипохромная теория, представляющая собой теоретическое обоснование гипохромного эффекта на основе электронного состояния молекулы биополимера, достаточно хорошо развита. Гипохромный эффект, сопровождающий изменение структу­ры биополимера, проявляется в спектрах поглощения в широ­кой области длин волн. Изменение интенсивности поглощения весьма значительно, и экспериментальное определение гипо­хромного сдвига не требует какой-либо специальной аппарату­ры.

Рис 8. Спектр поглощения полиадениловой кислоты в форме двойной спирали (1) и в состоянии статистического клубка (2)

Для этой цели может быть использован обычный ультра­фиолетовый спектрофотометр. Однако при работе в коротко­волновой области вплоть до 1800 Ǻ необходимо принимать меры, чтобы избежать помех, связанных с поглощением света кислородом. Достигнуть этого довольно легко, если заполнить всю оптическую систему газообразным азотом. В области еще более коротких волн необходимы специальные вакуумные ультрафиолетовые спектрофотометры, в которых применяются дифракционные решетки. Часто возникает потребность снять спектр поглощения биополимера при различных температурах. Тогда используют специальные термостатированные кюветы. В них кювета с образцом помещена в специальный держатель, где постоянная температура поддерживается в результате циркуляции жидкости из термостата. Чтобы предотвратить ис­парение легколетучих растворителей, кварцевые кюветы снаб­жают крышками. При длинах волн, близких к вакуумной ультрафиолетовой области (l<2000 А), поглощение раствори­телей становится достаточно интенсивным, и желательно, что­бы длина кюветы была по возможности невелика.

Гипохромный эффект у полипептидов и белков.

Рассмотрим электронное состояние полипептидов и нуклеиновых кислот. В состав пептидной группы входят атомы азота, углерода и кислорода, расположенные в одной плоскости. Валентное электронное состояние атомов пептидной группы приведено ниже:

О:(2s2p_x2p_y)²(2s2p_x2p_y)²(2s2p_x2p_y) (2р_z) = t²_rt²_rt_r p

С:(1 s )² (2s²p_x2p_y) (2s2p_x2p_y) (2s2p_x2p_y) (2рz) = t_rt_rt_r p

N: (1s)²(2s2p_x2p_y)(2s2p_x2p_y)(2s2p_x2p_y)(2p_z)² = t_rt_rt_r p

Мономер белковой цепи подобен молекуле амида R₁—CO—NH—R₂. Изучение электронных спектров поглощения амидов квантово-механическими расчётами [6] позволяет установить схемы электронных переходов (рис 9)

Рис 9. Электронные переходы в амидной группе p2 – связывающая орбиталь С=О p* – несвязывающая орбиталь С=О уровень p1 – несвязывающая орбиталь N уровень n0 – состояние неподелённой пары электронов атома O2

Переход ns* – атомный электронный переход в кислороде

Переход np* имеет малую дипольную силу, так как электронные облака n и p слабо перекрываются.

На рис. 10 показаны волновые функции амидной группы, соответствующие её наиболее подвижным электронам.

Переходный дипольный момент p,p* лежит в плоскости НNCO под углом 9⁰ к линии, соединяющей атомы О и N, а момент перехода np* перпендикулярен этой плоскости.

Рис 10. Волновые функции амидной группы

Изучая оптические свойства молекулярных кристаллов, Давыдов показал, что в регулярной совокупности тождественных хромофорных (светопоглощающих) групп между их возбуждёнными энергетическими уровнями может происходить резонансная передача энергии возбуждения. Распространяется энергия возбуждения – экситон (Френкель). В результате резонансного взаимодействия энергетические уровни расщепляются, образуется широкая зона. Для перехода p₁p* в a - спирали благодаря экситонному расщеплению полоса 190 нм расщепляется на две, одна из которых поляризована вдоль оси спирали, вторая перпендикулярна к ней (Dn~10 нм).

Рис. 11 Уровни энергии для системы параллельных (а) и коллинеарных (б) дипольных моментов переходов

Резонансное взаимодействие приводит к перераспределению интенсивности спектральных полос. В случае двух коллинеарных переходных диполей полоса с меньшей частотой (с большей длиной волны) увеличивает свою интенсивность за счёт интенсивности коротковолновой полосы. Возникает гиперхромизм в длинноволновой полосе. Напротив, в случае параллельных дипольных моментов понижается интенсивность длинноволновой полосы и увеличивается интенсивность коротковолновой. Возникает гипохромизм длинноволновой полосы.

Рис. 12 Спектр полиглутаминовой кислоты

Именно гипохромизм наблюдается в спектрах a-спиральных полипептидов и белков, а также двуспиральных нуклеиновых кислот. Если дипольные моменты перпендикулярны друг другу, то перераспределения интенсивности нет.

Например, гиперхромизм наблюдается экспериментально для полиглутаминовой кислоты (ПГК). На рис.12 показан спектр полиглутаминовой кислоты. При рН 4,9 ПГК находится в форме a-спирали, а при рН 8 – в форме статистического клубка. Интенсивность длинноволновой полосы a-спирали понижена примерно на 30% (сильный гипохромизм) за счёт регулярности a-спирали. Исчезновение гипохромизма при переходе спираль-клубок может дать количественную меру a - спиральности белка.

Одной из причин снижения интенсивности поглощения при гипохромном сдвиге является изменение ионизации биополимера при изменении рН водного раствора или других факторов. Другая причина — изменение направления моментов квантовых переходов мономерных остатков биополимеров, сопровождаю­щее переход к другой конформации. Так, для поли-L-глутаминовой кислоты изменение ионизации вызывает менее 1/3 наблю­даемого изменения интенсивности поглощения, тогда как доля гипохромного сдвига, обусловленная сменой направления мо­ментов квантовых переходов при изменении конформации, го­раздо значительнее. Спектр поглощения макромолекулы, имеющей упорядоченное строение в возбужденном состоянии, отражает взаимодействие между возбужденными мономерными звеньями и существенно зависит от пространственного распо­ложения их внутри молекулы.