Роль глицерина в защите от солевого стресса
Природные осмотически активные соединения синтезируются и накапливаются любым типом клеток в условиях осмотического стресса. Глицерин и другие полиспирты играют роль осмотически активных веществ в клетках дрожжей.
Замечено, что выбор иточника углерода в среде, степень засоления, отношение С/N в среде, фаза роста влияет на состав осмотически активных веществ в клетке. Например, для дрожжей Hansenula anomala â ýêñïîíåíöèàëüíîé ôàçå ðîñòà íà ñðåäå, ñîäåðæàùåé 2,25 Ì NaCl, îñíîâíûì îñìîòè÷åñêè àêòèâíûì ñîåäèíåíèåì ÿâëÿåòñÿ ãëèöåðèí (åñëè èñòî÷íèêîì óãëåðîäà ÿâëÿåòñÿ ãëþêîçà èëè ãëèöåðèí) èëè àðàáèòèí, ïðè ðîñòå íà àöåòàòå, èëè ïðè ïåðåõîäå êëåòîê â ñòàöèîíàðíóþ ôàçó ðîñòà [20]. Ó íåêîòîðûõ âèäîâ ñвободные аминокислоты также осуществляют часть осмобаланса, например глутамат и аспартат у Сandida membranefaciens [21], тогда как у Rhodotorula rubra пул свободных аминокислот и углеводородов уменьшается в условиях солевого стресса [22]. Некоторые сахара, например, трегалоза, накапливаются при осмотическом стрессе у ряда дрожжей [23].
Дрожжи S. cerevisiae отвечают на повышение осмотического давления среды путем увеличения продукции и внутриклеточного накопления глицерина. Накопленный таким образом глицерин работает как осморегулятор и осмопротектор ферментов в условиях стресса. Ген, кодирующй ключевой фермент синтеза глицерина, НАД-зависимую глицерофосфатдегидрогеназу (К.Ф.1.1.1.8, ГФДГ) S. cerevisiae, носит название GPD1. Ген GPD1 описан так же для Schizosaccharomyces pombe [24, 25].
Цитоплазматическая НАД-ГФДГ S. cerevisiae катализирует восстановление дигидроксиацетонфосфата (ДГАФ) до глицерофосфата, который впоследствии дефосфорилируется неспецифической фосфатазой до глицерина. Фермент существует в виде димера, одна субъединица которого имеет молекулярную массу около 42.000 Да. Оптимум рН для восстановления ДГАФ примерно 7,6. НАДФН не может заменить НАДН в качестве кофермента при восстановлении ДГАФ. Значения константы Михаэлиса (Км) для НАДН и НАДФН - 0,023 и 0.54 мМ, соответственно. Скорость обратной реакции окисления глицерофосфата составляет около 3% от скорости восстановления ДГАФ при рН 7,0. НАД, фруктоза-1,6-бисфосфат, АТФ и АДФ ингибируют активность ГФДГ [26]. Фермент выделен и описан также для D. hansenii [27].
У дрожжей (S. cerevisiae, Sch. pombe) существует еще один ген, GPD2, кодирующий ГФДГ. Однако его активность не увеличивается в условиях осмотического стресса [28, 29].
Мутанты по гену gpd1 синтезируют очень мало глицерина, и проявляют высокую чувствительность к осмотическому стрессу. Экспрессия гена GPD1 регулируется посредством пути через HOG-белок: мутанты hog1, утратившие протеинкиназу, вовлеченную в передачу сигналов, не способны увеличивать активность ГФДГ и уровень соответствующей мРНК при осмотическом стрессе. Однако, можно предположить существование альтернативного механизма регуляции накопления глицерина, так как штаммы, мутантные по hog1, сохраняют способность увеличивать содержание глицерина внутри клетки. хотя и в значительно меньших количествах, чем штамма дикого типа.
Дрожжи Z. rouxii являются солеустойчивым видом. Они способны нормально расти при широком спектре концентраций NaCl. Эти дрожжи синтезируют и запасают значительное количество глицерина в ответ на повышение концентрации NaCl в среде [30]. Однако, активность ГФДГ в экстрактах клеток Z. rouxii невысока, и не претерпевает значительных изменений в условиях солевого стресса [30], в отличие от S. cerevisiae и D. hansenii [31, 32]. Таким образом, у этого вида дрожжей можно предположить функционирование альтернативного путисинтеза глицерина из дигидроксиацетона.