Изучаемый препарат и протокол назначения
НОВЫЙ МЕТОД КАЛИБРОВКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ФСГ ОБЕСПЕЧИВАЕТ ПРЕДСКАЗУЕМОСТЬ КЛИНИЧЕСКОГО ОТВЕТА НА СТИМУЛЯЦИЮ
Hugues J.N., Barlow D.H., Rosenwaks Z., Cedrin-Durnerin I., Robson S., Pidoux L., Loumaye E.
Традиционно лекарственные препараты гонадотропинов количественно оценивают методом биологических проб на крысах в международных единицах (МЕ). Этот способ был разработан для решения проблемы вариабельности между различными партиями препаратов. Однако он не лишен недостатков, и неоднократно сообщалось о неадекватном ответе на стимуляцию различными партиями одних и тех же препаратов гонадотропинов мочевого происхождения. Технология производства рекомбинантного ФСГ позволила использовать для количественной оценки препаратов более современные физико-химические методики и дозировать их по массе белка ФСГ (в микрограммах – мкг). Настоящее исследование посвящено изучению клинической обоснованности нового способа количественной оценки препаратов ФСГ. Для изготовления четырех серий препарата, дозированных по результатам биопроб (МЕ), и четырех серий препарата, дозированного по массе (мкг), были использованы четыре партии первоисточника рекомбинантного человеческого ФСГ (рек-чФСГ). Полученные восемь серий препарата сравнивали в двойном слепом рандомизированном исследовании. В протокол вспомогательных репродуктивных технологий были включены 131 пациентка (66 в группу мкг и 65 в группу МЕ). Стартовая доза рекомбинантного человеческого ФСГ (рек‑чФСГ) составила 150 МЕ или 11 мкг в сутки. Протокол стимуляции у всех участниц исследования завершился пункцией фолликулов. Количество фолликулов диаметром ≥11 мм составило 14.85 и 14.91, эстрадиол сыворотки крови в день введения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) – 6524 и 6350 пмоль/л, количество полученных яйцеклеток – 10.76 и 11.28, количество яйцеклеток с двумя пронуклеусами (2 PN) – 5.2 и 5.0, количество жизнеспособных эмбрионов (перенесенных в полость матки и подвергнутых криоконсервации) – 4.15 и 3.72, частота клинических беременностей – 30.3 и 26.2% соответственно в группах мкг и МЕ. В целом, более устойчивый клинический ответ отмечен в группе препарата, дозированного по массе (Р=0.039), особенно по показателю клинических беременностей (Р<0.001). Новый метод количественной оценки рек-ФСГ обеспечивает предсказуемость клинического ответа на стимуляцию.
Ключевые слова: вспомогательные репродуктивные технологии, биологические пробы, ФСГ, гонадотропины, рекомбинантная ДНК
Введение
ФСГ представляет собой комплексный гетеродимерный гликопротеин, секретируемый в гипофизе. Препараты человеческого ФСГ применяют при бесплодии для стимуляции роста фолликулов у женщин и сперматогенеза у мужчин с гипогонадотропным гипогонадизмом. До 1995 года все препараты человеческого ФСГ получали из мочи постменопаузальных женщин (менотропин или человеческий менопаузальный гонадотропин (ЧМГ) и уротропин или мочевой человеческий ФСГ). Клиницисты неоднократно сталкивались с проблемой значительных колебаний биоактивности, иммунореактивности, доли содержания ЛГ и профиля гормональных изоформ при использовании препаратов мочевого происхождения, не только выпускаемых разными производителями (Harlin и соавт., 1986; Rodgers и соавт., 1995), но и , что представляется более важным, между различными промышленными партиями одного и того же препарата (Cook и соавт., 1988; Stone и соавт., 1989; Braileanu и соавт., 1998). Было продемонстрировано, что изменчивые качественные характеристики препаратов гонадотропинов сопровождаются непредсказуемым клиническим ответом на стимуляцию (Stone и соавт., 1989; Rector и соавт., 1993).
Для преодоления проблемы вариабельности препаратов мочевого происхождения активность ФСГ в различных партиях гонадотропинов оценивали методом биологических проб у крыс, предложенным Steelman и Pohley в 1953 году. Каждая производственная серия проходит тестирование на крысах для количественного определения ФСГ. Критерием оценки служит прирост массы яичников у крыс. Методика измерения массы яичников крыс не лишена недостатков, поэтому Европейская Фармакопея установила определенный диапазон активности, в пределах которого серия ФСГ признается годной для клинического применения. Практическим следствием такого подхода является то, что ампула с маркировкой 75 МЕ в действительности может содержать от 48 до 117 МЕ ФСГ.
В течение последних 30 лет предпринимались попытки заменить громоздкий метод биологических проб in vivo на иммунологические пробы или биопробы in vitro (Rose и соавт., 2000). Однако для точного определения терапевтической активности ФСГ эти методики оказались неэффективными, так как фармакокинетические характеристики ФСГ и активность взаимодействия с рецепторами в значительной степени зависит от его гликозилирования (Galway и соавт., 1990; Chappel и соавт., 1995; Vitt и соавт., 1998; Creus и соавт., 2001).
Технология рекомбинантной ДНК обеспечила возможность производства препаратов человеческого ФСГ (рек-чФСГ) очень высокой степени очищенности и постоянства состава in vitro (Recombinant Human FSH Development Group, 1998). Было продемонстрировано, что рекомбинантный ФСГ является наиболее эффективным препаратом для стимуляции роста фолликулов у человека (Daya и соавт., 2001). Однако технология производства рек-чФСГ по-прежнему включала оценку препарата методом биопроб по Steelman-Pohley. Высокая степень очищенности препарата позволила также оценивать и контролировать каждую прозводственную серию рек-чФСГ (Гонал-Ф, Сероно, Швейцария) с помощью физико-химических методов, включая SE-HPLC (ограничивающая по размерам жидкостная хроматография высокого исполнения), IEF (изоэлектрическое фокусирование) (Siebold и соавт., 1996) и гликановое картирование (Gervais и соавт., 2003). Первый из вышеперечисленных методов обеспечивает оценку целостности молекул ФСГ, два последующих – точную характеристику гликоформ ФСГ, представленных в препарате. Этот подход соответствует современной тенденции поиска альтернативных биологическому методов оценки эффективности белковых препаратов (Jeffcoate, 1994; Mulders и соавт., 1997).
В результате изучения более 100 промышленный партий этого препарата рек-чФСГ было продемонстрировано, что все серии характеризуются постоянным профилем гликозилирования, и существует постоянная зависимость между массой ФСГ (мкг) и его биологической активностью (Driebergen и соавт., 2002). Поскольку измерение массы ФСГ методом SE-HPLC является наиболее точным, было решено для калибровки каждой серии рек-чФСГ заменить им устаревший метод биопроб. Настоящее клиническое исследование посвящено оценки клинической эффективности усовершенствованного процесса производства.
Материалы и методы
Целью многоцентрового двойного слепого рандомизированного исследования параллельных групп было сравнение безопасности и эффективности различных серий препарата рек-чФСГ (Гонала-Ф), заполненных и дозированных по массе (мкг) и по данным биопроб (МЕ), в протоколах стимуляции множественного роста фолликулов для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Настоящее исследование проводилось в трех клинических центрах в соответствии со стандартами GCP (Good Clinical Practice), в том числе подразумевающих подписание пациентками информированного согласия до включения в протокол. Исследование было одобрено в каждом их трех этических комитетов.
Группа исследования
В исследование включены женщины с бесплодием, заинтересованные в наступлении беременности и имевшие показания для проведения вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО, ИКСИ). Критериями соответствия служили следующие: (1) бесплодие, требующее лечение методами вспомогательной репродукции; (2) показатели спермограммы партнера в течение 6 месяцев до начала протокола: >1.0 х 106 подвижных сперматозоидов (класса А или В) в 1 мл эякулята и показатель оплодотворения яйцеклеток ≥20% в любой из предыдущих попыток вспомогательных репродуктивных технологий; (3) возраст 18-38 лет (включительно), наличие спонтанного овуляторного менструального цикла продолжительностью 25-35 дней; (4) гормоны сыворотки крови в раннюю фолликулярную фазу (на 2-4 день менструального цикла): ФСГ<12 МЕ/л, ЛГ<13.5 МЕ/л, пролактин <800 мМЕ/л, эстрадиол <75 пг/мл; (5) наличие обоих яичников; (6) индекс массы тела (ИМТ) <30; (7) не более трех последовательных циклов вспомогательных репродуктивных технологий без наступления клинической беременности в анамнезе; (8) отсутствие признаков плохого ответа на стимуляцию гонадотропинами в предыдущих попытках; (9) наличие не более 13 фолликулов диаметром ≥4 мм и ≤8 мм в максимальном срезе одного яичника по данным трансвагинального ультразвукового исследования в раннюю фолликулярную фазу.
Основной целью настоящего исследования было подтвердить сопоставимую эффективность различных серий препарата рек-ФСГ, дозированных по массе и по результатам биопроб, для стимуляции множественного роста фолликулов у женщин, планирующих процедуру ЭКО с переносом эмбрионов. В статистическом анализе учитывали данные каждого протокола. Количество участниц исследования рассчитывали с учетом практических и статистических обоснований. В качестве значимого критерия эффективности был принят показатель максимального различия в два фолликула диаметром ≥11 мм. Используя односторонний показатель значимости 0.05 и принимая общее стандартное отклонение за 5.4, показатель эквивалентности двух изучаемых препаратов составил 70% в расчете на 65 участниц каждой группы.
Рандомизация
После подписания информированного согласия, оценки соответствия критериям включения в исследование и достижения десенситизации гипофиза с помощью агониста ГнРГ, пациенткам присваивался уникальный идентификационный номер в хронологически последовательном порядке. Этот идентификационный номер позволил в соответствии с компьютерной рандомизацией “вслепую” распределить участниц исследования для последующей стимуляции одной из восьми серий препарата рек-ФСГ, дозированного либо по массе (мкг), либо по результатам биопроб (МЕ). Распределение осуществляли как по препаратам, так и по центрам, таким образом, чтобы каждый центр работал с рек-ФСГ всех восьми серий.
Изучаемый препарат и протокол назначения
В исследовании изучали 8 серий препарата рек-чФСГ. Эти серии были получены из четырех различных партий первоисточников рек-чФСГ, при этом из каждого первоисточника были произведена одна серия, заполненная и дозированная по массе, и одна серия, заполненная и дозированная по результатам биопроб (рис.1). Препараты всех исследованных серий были выпущены компанией Laboratories Serono (Aubonne, Швейцария) в условиях одного производства (Serono Pharma Bari, Италия).
Рис.1. Схема производства четырех серий рек-чФСГ, дозированного по массе (мкг), и четырех серий, дозированных по результатам биопроб (МЕ)
рек-чФСГ, первоисточник 1 (2, 3, 4) (LSA)
Гонал-Ф, серия 2 (4, 6, 8), дозированный по биоактивности (SPB)
Гонал-Ф, серия 1 (3, 5, 7), дозированный по массе (SPB)
Полученный препарат был расфасован в ампулы по 75 МЕ рек-чФСГ или эквивалентным им 5.5 мкг ФСГ, содержащим 30 мг сукрозы и фосфатного буфера в форме лиофилизата. Стимуляцию рек-чФСГ начинали после (как минимум) 10 дней десенситизации гипофиза с помощью агониста ГнРГ, который назначали в виде ежедневных подкожных инъекций в область передней брюшной стенки. Стартовая доза ФСГ была фиксирована и составила 150 МЕ (т.е. две ампулы) в сутки в течение 5 дней (включительно). С 6-го дня стимуляции ее изменяли с учетом ответа яичников по данным ультразвукового и гормонального (эстрадиол) мониторинга. Максимально допустимой дозой считали 450 МЕ (т.е. 6 ампул) в сутки.
Для финального созревания яйцеклеток перед пункцией фолликулов назначали подкожное или внутримышечное введение до 10000 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) мочевого происхождения.
Пункцию фолликулов проводили через 34-38 часов после введения ХГЧ, полученные яйцеклетки оплодотворяли in vitro. В полость матки переносили не более трех эмбрионов. После пункции фолликулов назначали препарат натурального прогестерона вагинально вплоть до менструации или, в случае наступления беременности, как минимум, в течение ее первых трех недель. Регистрировали исходы каждого цикла (беременность или менструация).
В случае клинических подозрений на возможность развития синдрома гиперстимуляции яичников уменьшали дозу препарата рек-чФСГ или отменяли его последующее введение.
Результаты