Значения и перспективы клеточной инженерии.
Клеточная инженерия представляет собой эффективный способ модификации биологических объектов, позволяющих создавать новые ценные продуценты, как на организменном, так и на тканевом, и клеточном уровнях. Современная клеточная инженерия позволила обратить на пользу человека способность раковых клеток к неограниченному росту, превратив их в гибридомы – живые фабрики важнейших продуктов, в первую очередь моноклональных антител. В сравнении с генетической инженерией отмечается более крупномасштабный характер транспорта информации между живыми организмами с применением клеточной инженерии. Клеточная инженерия позволяет вводить в клетку целые геномы (ядерный, хлоропластный, митохондриальный), в то время как генетическая инженерия в основном нацелена на передачу индивидуальных генов. В то же время клеточная инженерия уступает генетической инженерии по уровню «интеллектуальной проработки» экспериментов: генно-инженерные разработки позволяют прицельно передать от донора к реципиенту строго определенный ген, в то время как применение клеточной инженерии связано со значительной неопределенностью в судьбе хромосом, ядер в целом, цитоплазмы и ее органелл как в процессе слияния клеток, так и при последующем культивировании клеток – гибридов, поэтому центр тяжести разработок в области клеточной инженерии приходится на скрининг клеточных популяций для выявления клеток с желаемыми свойствами.
Несмотря на очевидные успехи клеточной инженерии, все же наибольший интерес в последние время вызывают работы по целенаправленному изменению свойств сельскохозяйственных растений с помощью методов генной инженерии – конструирования и переноса генов в растительные клетки и в целые растения. В последние годы с появлением генно-инженерных методов клонирования генов и их переноса в растительные клетки, а затем в регенерируемые из них растения стало возможным заметно быстрее создавать новые сорта. Это направление, зародившееся лишь в середине 80-х гг., быстро набирает темп. Изолированно множество генов растения и микроорганизмов, кодирующих признаки продуктивности, устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды. Получено немало растений, содержащих такие гены. Растения, несущие в геноме чужеродные гены, т.е. трансгенные растения, постепенно внедряются в сельскохозяйственную практику, их вклад в производство сельскохозяйственной продукции быстро растет.
Одним из методических приемов переноса генов состоит в использовании патогенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, которая содержит Ti-плазмиду, ответственную за индукцию (побуждение) опухолей у двудольных растений. Технология введения чужеродных генов в эту плазмиду и последующее заражение растений агробактерией с измененной Ti-плазмидой на сегодняшний день наиболее хорошо отработана.
Существует два подхода переноса генов в растения:
1) первый состоит в том, что гены вводят в изолированные клетки, лишенные полисахаридных стенок, называемые протопластами и затем из этих клеток получают целое растение;
2) при втором подходе используют ДНК (Ti-плазмиду) микроорганизма Agrobacterium tumefaciens, способного заражать растительные клетки и переносить в них часть плазмиды вместе с любой содержащейся в ней чужой ДНК. Переносимый ген предварительно вводят в эту часть Ti-плазмиды.
Растения – источник пищи и в принципе обеспечивают потребности человека и животных набором тех соединений, которые клетки животных и человека не синтезируют сами. К таким соединениям относятся: незаменимые аминокислоты, многие витамины. Вместе с тем основные виды используемых в пищу растений неполноценны, т.е. дефицитны (для животных) по некоторым аминокислотам. В такие растительные корма необходимо добавить такие аминокислоты как лизин, треонин, триптофан.
Для сбалансирования растительных кормов налажено специальное крупномасштабное микробиологическое промышленное производство этих аминокислот, но решение проблемы нельзя еще считать окончательным. Генная инженерия может кардинально упростить решение этой задачи. В настоящее время выделены гены белков картофеля (пататин), фасоли (фазолин), гороха (легумин), кукурузы (зеин), составляющие основу кормов. Многие из этих генов удалось перенести в растения, что позволило увеличить в них содержание дефицитных аминокислот.
Другая идея – использовать искусственно (химически) синтезированные гены, кодирующие в большом количестве незаменимые аминокислоты. Такие эксперименты уже проводят с картофелем для повышения содержания в нем ценных аминокислот.
Следующее направление генно-инженерных работ – создание гербицидоустойчивых ценных видов культурных растений. Традиционные методы селекции с целью создания сортов, устойчивых к гербицидам, очень длительны и малорезультативны. Поэтому и здесь большие надежды возлагают на методы генной инженерии. Приведем некоторые примеры. Осуществлен успешный перенос гена устойчивости к гербицидам у Streptomyces в клетки сахарной свеклы. После этого регенерированные из них растения приобрели устойчивость к гербециду фосфинотрициану. Этим путем удалось получить устойчивые к гербицидам растения табака.
Еще одной областью применения генной инженерии является: в размягчении плодов помидоров при их хранении, ухудшающем потребительские качества плодов, участвует фермент полигалактуронидаза (ПГУ). Следовательно, возникает необходимость в подавлении активности данного фермента. Методом генной инженерии сконструирован ген, транскрипция которого приводит к образованию вместо природной мРНК фермента анти-мРНК. В результате в клетках растения, в которое перенесен искусственно созданный ген, накапливается анти-мРНК, которая ингибирует природную мРНК. Механизм подавления мРНК ПГУ в клетках томатов представляется следующим образом: накапливающиеся в клетках молекулы анти-ПГУ мРНК вступают в комплекс с мРНК ПГУ, в результате чего последние не в состоянии транслироваться. Анти-мРНК в данном случае действует подобно антителам, активирующим антигены. В результате этой сложной, но успешно проведенной работы был получен новый сорт помидоров с улучшенными свойствами, а именно способностью более продолжительное время не размягчаться при хранении. Этот сорт был получен всего за один сезон.
Был создан инсектицидоустойчивый трансгенный хлопчатник. В геном обычного хлопчатника введен ген ингибитора трипсина коровьего гороха, продукт которого подавляет активность протеаз в пищеварительной системе насекомых, т.к. известны многие токсины, продуцируемые микроорганизмами и эффективно убивающие разные виды насекомых, то в настоящее время гены этих токсинов используют с целью создания, например, трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку.
Предпринимаются попытки получения растений, устойчивых к вирусам, наносящим огромный урон сельскому хозяйству. Спектр вирусов, инфицирующих сельскохозяйственные растения, велик. Наиболее перспективным способом защиты растений от вирусов считают индуцирование растениям «иммунитета» к вирусам методом, сходным с иммунизацией. Например, ген белка оболочки вируса табачной мозаики перенесли в клетки табака и получили трансгенные растения, у которых 0,1 % всех белков листьев был представлен вирусным белком. Значительная часть таких растений при инфицировании вирусом не проявляла никаких симптомов заболевания. Молекулярный механизм подавления вирусной инфекции пока неясен. Существует несколько предположений: предполагают, что синтезирующийся в клетках белок оболочки вируса мешает вирусной РНК нормально функционировать и формировать полноценные вирусные частицы. В настоящее время планируется получить вирусорезистентные зерновые культуры.
Проводятся эксперименты по созданию растений, устойчивых к заболеваниям благодаря переносу в них вирусных генов в антисмысловой ориентации (т.е. анти – РНК вируса). Один из подходов повышения устойчивости растений к вирусам, не связанный с генной инженерией, основан на культивировании вирусов табачной и томатной мозаики и вирусов цитрусовых в специальных условиях (обработка азотной кислотой, повышение температуры), в результате чего они утрачивают патогенность. Такие ослабленные вирусы служат своеобразной вакциной для растений.
Перенос генов в растения может быть с успехом использован и для создания новых интересных форм в цветоводстве. С помощью генно-инженерных подходов получена, например, трансгенная петуния с белыми цветами.
Генная инженерия стремится изменить генетические свойства не только растений, но и ассоциированных с ними микроорганизмов. Растения получают из почвы лишь незначительную часть содержащегося в ней азота. Некоторые из них снабжают азотом симбиотические бактерии, которые живут в анаэробных условиях в клубеньках, образуемых на корневых волосках. За связывание атмосферного азота у азотфиксирующих клубеньковых бактерий Rizobium ответственны гены nif. Перенос nif-генов в генетический аппарат растений решил бы важнейшую агробиотехнологическую задачу, но сейчас удалось реализовать несколько иной подход, который позволяет усилить азотфиксирующие свойства симбионта донника путем увеличения в нем числа nif-генов.
Разработаны подходы для получения морозоустойчивых растений, основанные на генно-инженерных манипуляциях с Pseudomonas, осуществляющей с некоторыми растениями и содержащей белок, который ускоряет кристаллизацию льда. Когда из бактерий удаляют ген для этого белка, полученный штамм называют «лед-минус». Штамм «лед-минус», распыленный над клубнями картофеля, конкурирует с обычными бактериями, что, в конечном счете, приводит к повышению морозоустойчивости растений.
Все это – еще не готовые производственные биотехнологии, а лишь подготовка базы для их создания. Существует два тесно взаимосвязанных варианта будущего биотехнологического производства ценных продуктов из растений: культивирование целых растений и культивирование клеток.
Методы культивирования растительных клеток в питательных средах создали самостоятельную отрасль биотехнологического производства ценных препаратов. Если культуру получать из одной клетки, то все вновь выросшие клетки будут генетически идентичны и образуют клон. Такие клоны интенсивно размножающихся клеток, как и бактериальные культуры, - хорошие продуценты ценных растительных продуктов. Их производительность и экономичность зачастую значительно выше, чем у целых растений. В данном случае, как и при работе с бактериями, можно использовать клетки, которые в растениях производят нужный продукт, а можно целенаправленно изменить клетку с помощью методов генной инженерии, сделав ее ценным продуцентом необходимого продукта. В производстве уже используются клеточные культуры следующих природных продуцентов: клетки табака, производящие убихинон-10 (используется как витамин); культуру клеток барбариса, продуцирующую ятрорризин (спазмолитическое лекарственное средство), клетки воробейника, производящие шиконин (используется для лечения ран, ожогов, геморроя). Но промышленное производство этих культур, за исключением, например, продуцентов шиконина пока экономически не выгодно. Требуется дальнейшее усовершенствование технологии культивирования клеток и повышения их продуктивности.
Область клеточных биотехнологий в ближайшем будущем, после того как реализует свои возможности генная инженерия, станет важнейшим источником ценных продуктов. Сначала будут получены трансгенные растения, а затем на их основе – высокопродуктивные культуры клеток. Например, трансгенные растения рапса, в которые введены гены лей-энкефалина и других нейропептидов человека, соединенные с частью гена альбумина семян, продуцируют около 1 мг ценного рекомбинантного белка на 1 т семян. По оценкам представителей фирмы, создавших трансгенный рапс, с 1 га можно будет получать около 3 кг нейропептидов.
Обсуждая в 1989 г. на страницах журнала «Trends in Biotechnology» перспективы использования биотехнологии в разных сферах сельскохозяйственного производства, сотрудники Федерального института в Цюрихе Н. Гоч и П.Ридер пишут о значении таких направлений, как клонирование и перенос в растения новых генов, ответственных за устойчивость к заболеваниям и контролирующих образование важных с экономической точки зрения метаболитов. Предполагается, что до 2007 г. будет проведено картирование генов большинства используемых в сельском хозяйстве одно- и двудольных растений и реализован искусственный перенос в них дополнительных генов. Перспективы успешного переноса генов, ответственных за фиксацию молекулярного азота, пока оценивается невысоко из-за трудности решения этой проблемы. На данном этапе повышение эффективности фиксации азота за счет симбиотических и несимбиотических микроорганизмов представляется весьма реальным.
Говоря о быстром прогрессе в области генной инженерии растений, следует обратить внимание на то, что в самое последнее время возникло и ширится движение экологов, в частности «зеленых», против генно-инженерных работ с растениями. Они опасаются, что растения, которым придана устойчивость к гербицидам, могут быстро распространится в природе с непредсказуемыми последствиями для культурных растений. Эти опасения небезосновательны, поэтому можно ожидать, что генная инженерия растений будет развиваться преимущественно в направлении биотехнологического их использования. Основное внимание будет отдано культивированию клеток растений, которые продуцируют ценные препараты, а не созданию сортов полевых растений, устойчивых к химическим и биологическим вредителям. Это не относится к созданию растений, устойчивых к экстремальным условиям среды, ибо размножение соле-, засухо-, морозоустойчивых растений в любом случае будет полезным. Ведутся работы по строгому контролированию процесса опыления, которые в случае успеха помогут снять существующие опасения. В некоторых лабораториях пытаются получить растения с неактивной пыльцой (мужская стерильность), чтобы исключить распространение пыльцы трансгенных растений.
Задание 2. Ознакомиться с основными методиками, используемыми для оценки активности препаратов биогенных стимуляторов.
Общие положения.
Дрожжевой нефелометрический тест.
В стерильные пробирки разливают по 1 мл испытуемого препарата в соответствующем разведении (в качестве контроля используют воду), добавляют 5 мл раствора Рингера и 2 мл суспензионной культуры дрожжей с экстинцией по фотоколориметру равной 0,05. Опытные пробирки выдерживают в термостате при 27 – 28 °С в течение 16 –18 часов. После того, как в контрольных пробирках экстинция на ФЭКе достигнет 0,01, рост дрожжей прекращают погружением пробирок в кипящую воду. После охлаждения производят замер величины экстинции опытных пробирок и биологическую активность препарата выражают в величинах экстинции после вычитания показаний контрольных пробирок.
Полнота и объективность показаний этого теста позволяет использовать его в лабораториях, выпускающих препараты биогенных стимуляторов.
Определение бродильной энергии.
Принцип метода заключается в учете количества углекислого газа, выделяющегося при брожении. Используют 4 конические колбы, емкостью 150 – 200 мл, снабженные вентилями Мейселя и затворами Бунзена. Вентиль устроен так, что выделяющийся при брожении углекислый газ должен пройти через слой серной кислоты, оставить там водяные пары и выйти наружу через затвор Бунзена.
В бродильные колбы заливают 30 мл 17 % раствора сахарозы и 10 мл дрожжевой взвеси (10 г дрожжей прессованных в 100 мл воды очищенной). В две колбы приливают 10 мл препарата, закрывают пробками с затворами и взвешивают с точностью до 0,01 г. Колбы выдерживают при 22 – 27 °С 12 часов, после чего снова взвешивают и по убыли в весе колб рассчитывают степень активации, которую выражают в процентах по отношению к контролю.
Подъемная сила дрожжей.
Методика определения подъемной силы дрожжей основана на том, что в процессе брожения, образуется углекислый газ, что можно зафиксировать по всплыванию дрожжевых шариков, с фиксацией времени погружения и их всплывания.
Определение окисляемости.
Сущность этого метода основан на кипячении раствора испытуемого препарата в воде, свободной от окисляющихся веществ, в присутствии 25 % серной кислоты и 0,01 н раствора перманганата калия в течение 10 мин, добавляют 0,01 н раствор щавелевой кислоты, и титруют 0,01 н раствором перманганата калия, после чего определяют окисляемость – количество (мг) кислорода в 1 л препарата.
Задание 3. Приготовление экстракта алоэ и определение его окисляемости.
Получение листьев алоэ.
Консервация листьев алоэ:
Для приготовления экстракта алоэ используют доброкачественные листья алоэ в возрасте 1 – 3 лет, сочные, зеленовато-матового цвета. Допускаться использования листьев с подсушенными кончиками. Снятые с растения листья алоэ помещают в холодильник и консервируют в темноте при 6 – 8 °С в течение 15 – 20 суток. Затем проводят сортировку, отбраковывая почерневшие и пожелтевшие листья алоэ.
Приготовление экстракта алоэ:
0,1 кг консервированных листьев алоэ измельчают до кусочков размером 0,3 – 0,5 мм, используя для этого микроизмельчитель тканей, и экстрагируют водой очищенной в три приема. Вначале листья настаивают на холоде в течение 1 ч со 150 мл воды очищенной, затем кипятят 2 – 3 мин, жидкость сливают. К остатку добавляют 100 мл воды очищенной, смесь встряхивают и вновь доводят до кипения. После отделения и отжатия сырья жидкость объединяют с первичным сливом, оставшуюся мезгу заливают 50 мл воды, перемешивают и отжимают. Жидкость добавляют к ранее полученному экстракту, процеживают через 4 – 5 слоев марли или два слоя бязи.
Определение окисляемости:
2 мл экстракта разбавляют очищенной водой до 100 мл и 20 мл полученного раствора переносят в колбу (200 мл), содержащей 100 мл горячей очищенной воды, свободной от окисляющихся веществ. Добавляют 5 мл 25 % раствора серной кислоты, 20 мл 0,01 н раствора перманганата калия и кипятят на сетке 10 мин, отсчитывая время с момента закипания жидкости.
К горячему раствору прибавляют 20 мл 0,01 н раствора щавелевой кислоты, и жидкость титруют до слабо розового окрашивания 0,01 н раствором перманганата калия.
Разность между общим число мл 0,01 н раствора перманганата калия израсходованного на титрование, и числом мл 0,01 н раствора щавелевой кислоты должна быть не менее 7 и не более 9 мл.
1 мл 0,01 н раствора перманганата калия соответствует 0,08 мг кислорода. Окисляемость (х) – количество мг кислорода в 1 л препарата вычисляют по формуле:
Х= (а*0,08*100*1000)/2*20 = а*200,
где а – число мл 0,01 н раствора перманганата калия израсходованного на окисление препарата.
Доведение препарата до нормы:
Количество очищенной воды, необходимое для разведения экстракта, рассчитывают по формуле:
Х=((а-в)/1600)-в,
где а – окисляемость до разведения;
в – количество полученного экстракта.
Учитывая окончательный объем экстракта, к нему до разведения водой добавляют сухой хлорид натрия из расчета 0,8 %. В готовой продукции экстракт доводят до кипения и кипятят 2 – 3 мин, охлаждают и фильтруют. После этого к экстракту добавляют необходимое количество воды, согласно расчету окисляемости:
Числовые показатели: рН 5 – 6;
Окисляемость: 1400 – 1800 мг (О2)/л;
Содержание натрия хлорида: 0,83 – 0,87 %.
Литература:
1. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.
2. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.
3. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 1-ого Международного конгресса (Москва, 14 – 18 окт. 2002 г.). – М.: ЗАО «ПИК Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева. – 2002. – 544 с.
4. Валиханова Г.Ж. Культура клеток растений как объект биотехнологии: Курс лекций. – Казахстан: Казахский Национальный Университет имени аль-Фараби. – 2002.
5.Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.
6.Лекционный материал по биотехнологии.
7. Николаева Л.А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование: Текст лекций. – СПб.: СПХФИ. – 1992.
8. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.
9. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с.
10. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.
11. Чуешов В.И. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т./ Под ред. Чуешова В.И. – Харьков: МТК - Книга; Издательства НФАУ. – 2002. – 716 с.
Темы рефератов.
1. Получение лекарственных веществ на основе культур растительных клеток.
2. Производство дигоксина с использованием методов биотехнологии.
3. Получение лекарственных препаратов на основе культур клеток женьшеня, родиолы розовой, воробейника, стевии, наперстянки, табака.
4. Бактериальные удобрения
5. Бактериальные средства защиты растений
Занятие 10.
Получение различных классов веществ на основе культур растительных клеток и тканей
Вариант 1.
1. Для получения протопластов из клеток грибов используется:
а) лизоцим;
б) трипсин;
в) «улиточный» фермент;
г) пепсин.
2. Высокая стабильность протопластов достигается при хранении:
а) на холоду;
б) в гипертонической среде;
в) в среде с добавлением антиоксидантов;
г) в анаэробных условиях.
3. Полиэтиленгликоль, вносимый в суспензию протопластов:
а) способствует их слиянию;
б) предотвращает их слияние;
в) повышает стабильность суспензии;
г) предотвращает микробное заражение.
4. Гибридизация протопластов возможна, если клетки исходных растений обладают:
а) половой совместимостью;
б) половой несовместимостью;
в) совместимость не имеет существенного значения.
5. Превращение карденолида дигитоксина в менее токсичное соединение – дигитоксин осуществляется:
а) Acremonium chrysogenum;
б) Saccharomyces cerevisiae;
в) Digitalis lanata;
г) Tolypocladium inflatum.
Занятие 10.
Получение различных классов веществ на основе культур растительных клеток и тканей
Вариант 2.
1. За образованием протопластов из микробных клеток можно следить с помощью методов:
а) вискозиметрии;
б) колориметрии;
в) фазово-контрастной микроскопии;
г) электронной микроскопии.
2. Для получения протопластов из бактериальных клеток используется:
а) лизоцим;
б) «улиточный фермент»;
в) трипсин;
г) папаин.
3. Для протопластирования наиболее подходят суспензионные культуры:
а) в лаг-фазе;
б) в фазе ускоренного роста;
в) в логарифмической фазе;
г) в фазе замедленного роста;
д) в стационарной фазе;
е) в фазе отмирания.
4. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен с помощью:
а) микроинъекции;
б) трансформации;
в) упаковки в липосомы;
г) культивирования протопластов на соответствующих питательных средах.
5. Объединение геномов клеток разных видов и родов возможно при соматической гибридизации:
а) только в природных условиях;
б) только в искусственных условиях;
в) в природных и искусственных условиях.