Лоты и определение ее местонахождения в синтезирующейся белковой мо-

Лекуле осуществляет транспортная РНК (тРНК). На ДНК, как на матрице,

синтезируется РНК, а на РНК – белок. У некоторых вирусов отсутствует

Первое звено, и РНК служит для них материалом наследственности.

Механизм контроля генной активности долгое время оставался неиз-

Вестным. Большое значение имели работы Ф. Жакоба и Ж. Моно, пока-

Завшие, что у бактерий есть структурные гены, дающие информацию о

Синтезе определенных белков и регуляторные гены, которые осуществ-

Ляют включение или выключение отдельных генов или их блоков. Далее

Выяснилось, что регуляция генов по этому принципу имеет место и у дру-

Гих организмов. Существуют также иные механизмы регуляции.

Следующим важным шагом было проведение работ по расшифровке

Нуклеотидных последовательностей (секвенирование), которое дает ин-

Формацию о первичной структуре участка генома, выполняющего опреде-

Ленные функции. Структура и функции приобрели общее молекулярно-

Биологическое выражение, его суть заключается в том, что функциональные

Состояния выражают структурные изменения макромолекул и ассоциаций.

От изучения закономерностей функционирования генетического мате-

Риала в клетке вскоре исследователи перешли к генетическим манипуля-

Циям. Возникла новая экспериментальная технология, заключающаяся в

введении в клетки чужеродных генов. Названия «генетическая (или ген-

ная) инженерия» или «работа с рекомбинантными ДНК» эквивалентны.

Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in

vitro с последующим введением новых («рекомбинантных») генетиче-

Ских структур в живую клетку.

В 1972 г. Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную моле-

Кулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага

λ dvgal с галактозным опероном E. coli. Инструментом для генетического

конструирования стали две группы ферментов – рестриктирующие эн-

Донуклеазы (рестриктазы) и лигазы. Первые необходимы для получе-

ния однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестрик-

Тазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обрат-

Ной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение

Всех генноинженерных манипуляций.

Техника генетического конструирования in vitro включает несколько

последовательных процедур (рис. 4.1):

Получение нужного гена;

Встраивание его в генетический элемент, способный к репликации

(вектор);

Введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;

Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели же-

Лаемый ген или гены.

ДНК

ДНК

5’

3’ 5’

G 3’

G

G

G

A

A

A

A

A

A

T

T

T

T

T

T

C

C

C

C

Эндонуклеаза

Эндонуклеаза

Расщепленная

Плазмида

Рекомбинантная

Плазмида

Введение

Рекомбинантной

Плазмиды

В кишечную

Палочку

Плазмида

Чужеродный ген (ДНК)

Клонирование гена

Лигаза

Плазмиды

Хромосома

A A T T

С

С

С

С

T

T

T

T

T

T

T

T

T T T T

T T

T T

T T

T T

T T

T T

A

A

A

A

A

A

A

A

A A

A A

A A

A A

AA AA A A

A A

G

G

T

T

T

T

A

A

A

A

+

Рис. 4.1. Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках

(по А. Сассону, 1987).

Плазмида E.coli расщепляется рестриктазой в обеих частях ДНК с образованием на концах неспаренных

Нуклеотидов (ТТАА или ААТТ). Ген выщеплен с помощью этой же рестриктазы с образованием на концах,

Комплиментарных плазмиде, последовательностей (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают с

Помощью лигазы. Гибридную плазмиду вводят в E. coli, которая при размножении образует клон, все клет-

Ки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной

Клетке и индуцирует в ней синтез белка.

Получение генов

Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК,

Химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.

Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализи-