Микрочипы на основе малых молекул

Направления белковой инженерии.

Основными направлениями белковой инженерии в настоящее время являются: 1) структурно- функциональный анализ белков методами сайт-направленного мутагенеза отдельных аминокислотных остатков; 2) создание химерных и мультифункциональных белков;3) случайный мутагенез и селекция белков с определенной функцией (молекулярная эволюция); 4) создание искусственных белков de novo.

Одним из примеров может служить осуществление сайт-специфического мутагенеза. Он происходит следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подходящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов.

Мутации, вызываемые путем сайт-специфичного воздействия, используют сегодня для проверки адекватности результатов структурных исследований. В некоторых случаях с их помощью удалось показать, что структурная стабильность белка и его каталитическая активность могут быть разобщены. Накопилось достаточное количество информации о взаимосвязи между стабильностью структуры белка и его функцией, мы, возможно, сумеем осуществлять тонкую регуляцию активности биологических катализаторов и создавать полностью синтетические их аналоги. Недавно появилась работа, в которой сообщалось о клонировании первого синтетического гена фермента, кодирующего активный фрагмент молекулы рибонуклеазы

Направленная модификация белка. При направленной модификации белка ученый использует детальное знание структуры и функции белка, чтобы внести нужные изменения. Как правило, этот метод имеет то преимущество, что он недорогой и технически несложный, так как техника сайт-направленного мутагенеза хорошо развита. Однако, его основным недостатком является то, что сведения о подробной структуре белка часто отсутствуют, и даже когда структура известна, может быть очень трудно предсказать влияние различных мутаций.

Программные алгоритмы модификации белка стремятся к выявлению новых аминокислотных последовательностей, которые требуют мало энергии для формирования предопределенной целевой структуры. В то время как последовательность, которая должно быть найдена, велика, наиболее сложным требованием для модификации белка является быстрый, но точный, способ для выявления и определения оптимальной последовательности, в отличие ее от аналогичных субоптимальных последовательностей.

Перспективы.

Современный уровень развития белковой инженерии открывает широкие перспективы как для фундаментальной молекулярной биологии, так и для ее практического применения. Белковая инженерия использует комплекс современных подходов для структурно- функционального анализа белков, что позволяет вводить направленные мутации в любые сайты белка, изучать структуру и тонкие механизмы функционирования ферментов. На основании использования структурного анализа белков и компьютерного моделирования могут быть созданы новые мутантные белки для медицинских целей, например, цитокины с усиленной биологической активностью, модификационные антитела. На основе экспрессии in vivo мутантных белков с измененными свойствами (усиленное или ослабленное действие, элиминация сайтов фосфорилирования, протеолиза) возможно создание нового аодхода в генной терапии. Повышение стабильных белков методами направленного изменения их структуры расширяет возможности их применения в различных областях биотехнологии. Новым направлением использования белковой инженерии может быть ее союз м микроэлектроникой и создание новых биосенсоров. В свою очередь, это открывает возможности появления исключительно малых быстродействующих биочипов.

Биосенсоры
Биосенсорная технология сочетает в себе достижения биологии и современной микроэлектроники. Биосенсор обычно состоит из биологического компонента (клетки, фермента или антитела), соединенного с крошечным преобразователем – прибором, приводимым в действие одной системой и передающим энергию (обычно в другой форме) другой системе. Бисенсоры являются детекторами, действие которых основано на специфичности клеток и молекул и используется для идентификации и измерения количества малейших концентраций различных веществ.

При связывании искомого вещества с биологическим компонентом биосенсора преобразователь генерирует электрический или оптический сигнал, мощность которого пропорциональна концентрации вещества. Биосенсоры могут быть использованы для:

– измерения пищевой ценности, свежести и безопасности продуктов питания;
– экспресс-анализа крови непосредственно у кровати больного;
– обнаружения и измерения степени загрязнения окружающей среды;
– детекции и определения количества взрывчатых веществ, токсинов и возможного биологического оружия.

Нанобиотехнология
Нанотехнология, появившаяся в 2000 году одновременно с возникновением Национальной нанотехнологической инициативы (оставим этот америкоцентризм на совести авторов – КБ), является следующим шагом на пути человечества к минимизации, которая уже дала нам микроэлектронику, микрочипы и микросхемы. Слово нанотехнология произошло от единицы измерения нанометр, составляющей одну тысячную микрометра (микрона), что является приблизительным размером молекулы. Нанотехнология – изучение, производство и манипуляции над сверхмалыми структурами и приспособлениями, состоящими из одной молекулы, – возникла благодаря созданию микроскопических приборов, обеспечивающих возможность визуализации отдельных молекул, манипулирования ими и измерения возникающих между ними электромагнитных взаимодействий.

Нанобиотехнология объединяет в себе достижения нанотехнологии и молекулярной биологии. Молекулярные биологи помогают нанотехнологам научиться понять и использовать наноструктуры и наномеханизмы, созданные в результате процесса эволюции, длившегося 4 миллиарда лет, – клеточные структуры и биологические молекулы. Использование особых свойств биологических молекул и клеточных процессов помогает биотехнологам в достижении целей, перед которыми бессильны другие методы.

Нанотехнологи также пользуются способностью биомолекул к самосборке в наноструктуры. Так, например, липиды способны спонтанно объединяться и формировать жидкие кристаллы.

ДНК используется не только для создания наноструктур, но и в качестве важного компонента наномеханизмов. Вполне вероятно, что ДНК, представляющая собой молекулу, хранящую информацию, может стать основным компонентов компьютеров следующего поколения. Вместо того, чтобы создавать кремниевую основу микросхемы, нанотехнологи смогут использовать двухцепочечную молекулу ДНК, которая представляет собой натуральный каркас для создания наноструктур, а ее способность к высокоспецифичному связыванию позволяет объединять атомы в предсказуемой последовательности, необходимой для создания наноструктуры.

К тому времени, как микропроцессоры и микросхемы превратятся в нанопроцессоры и наносхемы, молекулы ДНК могут заменить используемые в настоящее время неорганические полупроводники. Такие биочипы будут представлять собой ДНК-процессоры, использующие исключительную способность ДНК к хранению информации. Концептуально они будут очень отличаться от биочипов, описанных в одном из следующих разделов. По расчетам, процессор, содержащий 1000 молекул ДНК, в течение четырех месяцев сможет справиться с задачей, для решения которой современному компьютеру требуется не менее ста лет.

Другие биологические молекулы тоже помогают нам в постоянной гонке за созданием способов передачи как можно большего количества информации в как можно меньших объемах. Например, некоторые исследователи используют поглощающие свет молекулы, такие же, как содержатся в сетчатке, для тысячекратного увеличения способности компакт-дисков к хранению информации.

К практическим применениям нанобиотехнологии относятся:

– увеличение скорости и точности диагностики заболеваний;
– создание наноструктур для доставки функциональных молекул в клетки-мишени;
– повышение специфичности и скорости доставки лекарств;
– миниатюризация биосенсоров путем объединения биологического и электронного компонентов в один мельчайший прибор;
– способствование развитию экологически чистых производственных процессов.

Микрочипы
Технология микрочипов – это принципиално новый уровень лабораторных исследований, так как она позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Тысячи молекул ДНК или белков помещаются на стеклянные пластинки для создания ДНК- и белковых чипов соответственно. В последних разработках стеклянные пластинки заменяются особым образом изготовленными стеклянными шариками.
ДНК-микрочипы

ДНК-микрочипы используются для:
– идентификации мутаций в генах, связанных с различными заболеваниями;
– наблюдения за активностью генов;
– диагностики инфекционных заболеваний и определения наиболее эффективного метода антибиотикотерапии;
– идентификации генов, важных для продуктивности сельскохозяйственных культур;
– скрининга микроорганизмов, как патогенных, так и полезных, например, используемых для восстановления зараженных органическими отходами почв.

ДНК-микрочипы необходимы для практического использования информации, полученной в результате секвенирования геномов человека и других живых организмов. Известные последовательности генов и геномные карты значат не так уж много до тех пор, пока не определены функции входящих в их состав генов. Без белковых микрочипов эта работа является настолько же трудоемкой, какой была расшифровка геномов до появления современных секвенаторов.
Белковые микрочипы
Переход от ДНК-микрочипов к белковым микрочипам выглядит вполне логичным шагом, однако его осуществление достаточно проблематично. Структура и функции белковых молекул намного сложнее, чем у молекул ДНК. К тому же белки намного менее стабильны. Каждый тип клеток содержит тысячи различных белков, некоторые из которых обладают уникальными, характерными только для определенного типа клеток, функциями. Кроме того, белковый состав клетки меняется в зависимости от состояния здоровья, возраста и влияния окружающей среды.

Белковые микрочипы будут использоваться для:

– обнаружения белковых биомаркеров, характерных для различных заболеваний и даже разных их стадий;
– оценки потенциальной эффективности и токсичности препаратов в доклинических испытаниях;
– измерения различий в синтезе белков различными типами клеток, клетками, находящимися на разных стадиях развития, а также здоровыми и патологически измененными клетками;
– изучения взаимосвязи между структурой и функциями белков;
– оценки различий в экспрессии белков с целью выявления мишеней для новых лекарственных препаратов;
– изучения взаимодействий между белками и другими молекулами.

Фундаментальный принцип, лежащий в основе технологии микрочипов, вдохновил исследователей на создание большого количества устройств для решения широкого спектра научных задач и создания новых продуктов.

Тканевые микрочипы,

позволяющие проводить анализ тысяч образцов тканей на одном предметном стекле, используются для определения содержания белков в здоровых и патологически измененных тканях и оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов. Образцы ткани мозга, размещенные на предметных стеклах, позволяют исследователям измерять изменение электрической активности нервных клеток при различных воздействиях.

Клеточные микрочипы

позволяют избежать проблемы нестабильности белков в белковых микрочипах и производить более точный анализ взаимодействий белков внутри клетки.

Микрочипы на основе малых молекул

позволяют фармакологическим компаниям производить одновременный скрининг тысяч потенциальных лекарственных средств.