Пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента.
пределение влияния pH на работу фермента.
Опыт проводили в двух повторностях. К 0,4 мл раствора сахарозы (концентрация 2x10-2 M) добавляли 0,1 мл разведённого в 5000 раз раствора фермента в буфере с различным pH (3,2 – 7,2). В течение 9 минут проводили инкубацию при температуре 30oC. Поcле проведения гидролиза добавляли 2 мл раствора ДНСК и ставили пробирку на кипящую водяную баню на 15 минут. Растворы охлаждали, добавляли 7,5 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при λ = 470 нм.
| pH раствора фермента | 3,2 | 4,2 | 5,2 | 6,2 | 7,2 |
| D470 средн. | 0,120 | 0,314 ± 0,001 | 0,339 ± 0,038 | 0,334 ± 0,002 | 0,095 ± 0,035 |
Определение термостабильности фермента инвертаза.
Определение проводили в трёх повторностях. В отличии от предыдущих опытов, pH гидролиза был оптимальным – 5,2. Концентрация субстрата - 3x10-2 M. Раствор фермента изначально был прогрет до 35-65 градусов с интервалом в 5oC. Определение концентрации продуктов проводили аналогично. Результаты приведены в таблице и графике.
| Темп. предварит. прогрева | 1-я проба | 2-я проба | 3-я проба | Среднее значение |
| Без прогрева | 0,387 | 0,381 | 0,342 | 0,370 ± 0,024 |
| 35oC | 0,337 | 0,348 | 0,293 | 0,326 ± 0,029 |
| 40oC | | 0,363 | 0,341 | 0,353 ± 0,016 |
| 45oC | 0,243 | 0,248 | 0,252 | 0,248 ± 0,005 |
| 50oC | 0,324 | 0,339 | 0,333 | 0,332 ± 0,008 |
| 55oC | 0,277 | 0,289 | 0,325 | 0,297 ± 0,025 |
| 60oC | 0,130 | 0,130 | 0,158 | 0,139 ± 0,016 |
| 65oC | 0,014 | 0,000 | 0,000 | 0,005 ± 0,008 |
пределение удельной активности фермента.
Удельная активность фермента рассчитывается как отношение вступившего в реакцию субстрата на единицу времени и единицу массы фермента.
Для расчётов была выбрана точка 9` при концентрации субстрата 0,01М в первом опыте. В результате гидролиза образовалось 489,2 мкг альдаровых кислот (молярная масса – 210 г/моль) в 1 мл раствора или 2,33 μмоль/мл. Из 1 моля сахарозы образуется 2 моль альдаровых кислот. Следовательно, в реакцию вступило 1,16 μмоль/мл сахарозы.
Для определения массы фермента использовался метод Лоури.
Опыт проводили в двух повторностях. К 1 мл разведённого в 20 раз фермента добавили 5 мл «реактива С», провели инкубацию в течение 10 минут, добавили 0,5 мл реактива Фолина и оставили при комнатной температуре на 30 минут. При λ=750нм определяли оптическую плотность. Концентрацию белка расчитывали по калибровочной кривой (см. приложение), построенной по стандартным растворам белка. Уравнение кривой – y=0,0018x
Среднее значение оптической плотности составило 0,279 оптических единиц, что составляет 155 мкг белка в мл раствора белка 1:20. Соответственно, в растворе 1:5000 содержится 6,2x10-4 мг/мл фермента.
Итого, удельная активность фермента: 
.
пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента.
Для вычисления константы Михаэлиса были проведены ферментативные реакции гидролиза сахарозы в концентрациях от 0,01 до 0,05 моль/л (в трёх повторностях каждой концентрации). Концентрации продуктов были определены по методу ДНСК аналогично предыдущим опытам.
Результаты определения и расчитанные параметры приведены в таблице.
| [S], M | D470(1) | D470(2) | D470(3) | D470 av. | ∆S, M | V,mol/l*min | E, μmol/(min*mg) | 1/V | 1/S | V/S |
| 0,008 | 0,359 | 0,430 | 0,351 | 0,380 | 1,392E-03 | 1,988E-04 | 320,72 | 5028,95 | 125,00 | 0,0249 |
| 0,016 | 0,634 | 0,652 | 0,650 | 0,645 | 2,364E-03 | 3,377E-04 | 544,67 | 2961,26 | 62,50 | 0,0211 |
| 0,024 | 0,819 | 0,790 | 0,850 | 0,820 | 3,002E-03 | 4,289E-04 | 691,81 | 2331,44 | 41,67 | 0,0179 |
| 0,032 | 0,999 | 0,999 | 1,010 | 1,003 | 3,673E-03 | 5,247E-04 | 846,26 | 1905,92 | 31,25 | 0,0164 |
| 0,04 | 1,120 | 1,095 | 1,021 | 1,079 | 3,951E-03 | 5,645E-04 | 910,41 | 1771,63 | 25,00 | 0,0141 |
| График зависимости скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата, как и предполагалось, имеет вид логарифмической кривой. |  |
Далее, с помощью графика в двойных обратных координатах и графика Иди-Хофсти (см. приложение) были определены константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции.
Km = 0,035 моль/л, Vmax = 0,0011 моль/(мин*л).
Выводы
1. В процессе выполнения работы было определено оптимальное время инкубации фермента с субстратом – 7 минут, оптимальная концентрация субстрата – 0,02 моль/л.
2. Оптимальный pH для работы фермента – 5,2.
3. Изучение термостабильности показало значительное падение активности фермента после прогревания при температуре cвыше 55oC.
4. Константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции были определены на уровне 0,035 моль/л и 0,0011 моль/(мин*л) соответственно.
Приложение
